Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Analytické metody Vladimíra Kvasnicová. 1.SPEKTROFOTOMETRIE 2.CHROMATOGRAFIE 3.POTENCIOMETRIE 4.VOLUMETRIE.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Analytické metody Vladimíra Kvasnicová. 1.SPEKTROFOTOMETRIE 2.CHROMATOGRAFIE 3.POTENCIOMETRIE 4.VOLUMETRIE."— Transkript prezentace:

1 Analytické metody Vladimíra Kvasnicová

2 1.SPEKTROFOTOMETRIE 2.CHROMATOGRAFIE 3.POTENCIOMETRIE 4.VOLUMETRIE

3 Spektrofotometrie spektrofotometr

4 Materiál používaný pro analýzu: ROZTOK

5 PRINCIP interakce mezi stanovovaným analytem a monochromatickým zářením část záření je absorbována stanovovanou látkou, zbývající záření je detekováno detektorem množství absorbovaného záření je přímo úměrné množství analyzované látky

6 Spektrofotometrie je kvantitativní metoda: stanovujeme KONCENTRACI  koncentrace  tmavší roztok   absorpce

7 Důležité termíny vzorek = analyzovaný roztok neznámý vzorek = vzorek o neznámé koncentraci standard = vzorek o známé koncentraci blank = roztok neobsahující analyzovanou látku chromofor = část struktury chemické látky, která je schopna absorbovat záření určité vlnové délky

8 fialová380 – 450 nm modrá450 – 495 nm zelená495 – 570 nm žlutá570 – 590 nm oranžová590 – 620 nm červená620 – 750 nm viz.

9 Obrázek převzat z (2006)http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum

10 Používané elektromagnetické záření barevné vzorky: viditelné (VIS) bezbarvé vzorky: UV záření

11 A / „absorpční spektrum“

12 Komplementární barvy

13 SCHÉMA spektrofotometru

14 Které veličiny jsou měřeny? TRANSMITANCE = poměr intenzity záření vystupujícího z kyvety (I) k intenzitě záření do kyvety vstupující (I o ) (tj. záření dopadající na detektor / původní záření) T = I / I o T = 0 – 1 nebo v procentech % (0 – 100 %)

15 Jak se vyjadřuje množství pohlceného záření? veličina odvozená od transmitance: ABSORBANCE A = - log 10 T = - log 10 (I/I 0 ) = log 10 (I 0 /I) = log 10 (1/T) A = 0 – 1.0 (1.5 nebo více) horní limit závisí na citlivosti detektoru

16 Tprošlo (%)pohlceno (%)A

17 Tprošlo (%)pohlceno (%)A  citlivosti detektoru

18 Zjištění koncentrace: 1.Lambert-Beerův zákon 2.Kalibrační křivka 3.Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních vzorků

19 Zjištění koncentrace: Lambert-Beerův zákon A =  x l x c nebo T = 10 - (  x l x c) A = absorbance (A = -log T) T = transmitance (T = 10 -A )  = molární absorpční („extinkční“) koeficient l = tloušťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace

20 Kalibrační křivka 3 a více standardů zpracovaných stejnou metodou lineární kalibrační křivka A =  x l x c y = kx + q

21 Výpočet pomocí standardů A st = c st x l x  A vz = c vz x l x  A st / c st = l x  A vz / c vz = l x  l x  = l x  A st / c st = A vz / c vz c vz = A vz x (c st / A st ) c vz = A vz x f f = průměr všech (c st / A st ) použitých při experimentu

22 Cvičení 1) A vz = 0,25C vz = ? A st = 0,40C st = 4mg / L 2) standard glukózy: Cs = 1000mg/L, T = 0,49. neznámý vzorek: T = 0,55, C vz = ? (v mg/L i mmol/L) MW = 180g 3) standard proteinů: T = 0,33; vzorek pacienta: T = 0,44 Porovnejte koncentraci proteinů ve vzorku pacienta se standardem.

23 Přesnost stanovení absorpce ostatními látkami přítomnými ve vzorku musí být eliminována: BLANK (slepý pokus) → jeho absorbance se odečte od absorbance vzorku  výsledná absorbance odpovídá pouze koncentraci analyzované látky

24 Spektrofotometrie v praktickém cvičení „Stanovení koncentrace kreatininu v moči“ analyzovaný vzorek: vlastní moč 1.bezbarvý kreatinin je převeden na barevný produkt chemickou reakcí 2.koncentrace kreatininu ve vzorku se zjišťuje z naměřené absorbance pomocí kalibrační křivky

25 Chromatografie chromatograf

26 Všechny chromatografické techniky nejsou instrumentální... TLC chromatografie = úkol v praktiku

27 PRINCIP Separace směsi různých látek je založena na rozdílné distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze: stacionární fáze (pevná nebo kapalná) mobilní fáze (kapalná nebo plynná) Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární fázi rozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinitě k fázím.

28 pokud je „afinita“ látky k mobilní fázi vysoká, látka putuje systémem rychleji než látka s nižší afinitou pokud je „afinita“ látky ke stacionární fázi vysoká, látka je ve stacionární fázi déle zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji než látka mající nižší afinitu

29 Obrázek převzat z (listopad 2006)http://www.chemistry.vt.edu/chem-ed/sep/lc/lc.html

30

31 Co je cílem analýzy? 1.rozdělit (separovat) od sebe jednotlivé látky 2.identifikovat látky (= kvalitativní analýza) 3.stanovit koncentraci přítomných látek (= kvantitativní analýza)

32 Klasifikace chromatografických technik 1)podle mobilní fáze  kapalinová chromatografie (LC)  plynová chromatografie (GC) 2)podle uspořádání  planární (rovinná) chromatografie  chromatografie v koloně

33 kapalinová v koloně „manuální“ chromatografie

34 kapalinová v koloně „instrumentální“ chromatografie

35 kapalinová planární chromatografie příklad:

36 Plynová chromatografie (GC) Obrázek převzat z (listopad 2006)http://www.cofc.edu/~kinard/221LCHEM/

37 3)podle fyzikálně-chemických interakcí  adsorpční chromatografie  rozdělovací chromatografie  gelová permeační chromatografie (GPC)  chromatografie na iontoměničních (IONEX)  afinitní chromatografie

38 Fyzikálně-chemické mechanismy separace adsorpcerozpouštění sítový efekt – gelová chromatografie iontová výměna specifická interakce- afinitní chromatografie Snímek převzat z prezentace analyticke_metody / Petr Tůma

39 Obrázek převzat z (listopad 2006)http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm

40 Obrázek převzat z (listopad 2006)http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm

41 Obrázek převzat z (listopad 2006)http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm

42 Vyhodnocení chromatogramu Porovnání skvrn se standardy: R f = a /b R f = retardační faktor („rate of flow“) a = vzdálenost start-střed skvrny b = vzdálenost start-čelo mobilní f. 1) planární chromatografie (př. TLC) „b“ „a“ Obrázek převzat z (listopad 2006)http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm

43 2) chromatografie v koloně (HPLC, GC) Porovnání „píků“ se standardy: t R = retenční čas  identifikace látek h = výška píku  koncentrace látek „píky“

44 Chromatografie v praktickém cvičení „ TLC lipofilních barviv“ = adsorpční planární kapalinová chromatografie mobilní fáze: toluen (nepolární) stacionární fáze: destička se silikagelem (polární) stadardy barviv → porovnání R f neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva

45 „Demonstrace HPLC a GC“ HPLC = High Performance Liquid Chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) normální nebo reverzní fáze princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.) GC = Gas Chromatography (plynová chromatografie)

46

47 Potenciometrie potenciometr

48 PRINCIP Potenciometrie je elektrochemická metoda založená na měření napětí elektrochemického článku za bezproudého stavu. dvě elektrody: indikační (měřící) elektroda referentní (srovnávací) elektroda

49 Schéma:

50 Elektrody indikační elektroda její potenciál závisí na složení roztoku referentní elektroda její potenciál je stabilní (konstantní, známý) Měřit přímo potenciál jako takový nelze  měříme rozdíl potenciálů (=napětí)

51 indikační elektrody Obrázek převzat z (2006)http://food.oregonstate.edu/images/ph/beck8.jpg

52 Nernstova rovnice E = E 0 + (RT/nF) ln a M E = elektrodový potenciál E 0 = standardní elektrodový potenciál R = molární plynová konstanta (8.314 J K -1 mol -1 ) F = Faradayova konstanta ( C mol -1 ) T = absolutní teplota (25 0 C = 298 K) n = náboj stanovovaného iontu (M) a = aktivita stanovovaného iontu

53 E = E 0 + (RT/nF) ln a M ln a = log a; dosazeno za R, T a F  E = E 0 + (0.059/n) log a M ! DŮLEŽITÉ ! elektrodový potenciál závisí na teplotě roztoku, aktivitě („koncentraci“) a náboji stanovovaného iontu elektrodový potenciál nepotřebujeme počítat: ke kalibraci potenciometru používáme standardy

54 Obecná klasifikace elektrod 1)elektrody I. druhu (kovové nebo plynové) 2)elektrody II. druhu (kov + jeho nerozpustná sůl) → REFERENTNÍ ELEKTRODY 3)redoxní elektrody (Pt, Au) 4)membránové elektrody → ISE = iontově selektivní elektr. (stanovení iontů v medicíně: H +, Na +, K +, Cl -,...)

55 „Standardní vodíková elektroda“ (SHE) plynová elektroda její potenciál byl definován: E SHE = 0 za všech podmínek REFERENTNÍ ELEKTRODA, ale v praxi se běžně nepoužívá

56 Referentní elektrody kalomelováargent-chloridová SHE

57 „Skleněná elektroda“ = ISE (H + ) stanovení pH membránová electroda

58 Membránové elektrody na stanovení plynů

59 elektroda používaná na stanovení CO 2 v krvi

60 Potenciometrie v praktickém cvičení „ Měření pH fosfátového pufru“ roztoky fosfátového pufru o různém složení stanovení pH pomocí pH-metru (= upravený potenciometr) kalibrace přístroje pomocí standardů skleněná kombinovaná elektroda („dvojče“)

61 Skleněná kombinovaná elektroda

62 Skleněná kombinovaná elektroda v praktiku

63 Volumetrie (= titrace, odměrná analýza)

64 Metoda založená na chemické reakci mezi analyzovanou látkou a tzv. odměrným roztokem byreta s odměrným roztokem titrační baňka s naředěným analyzovaným vzorkem titrace = zjištění přesné koncentrace vzorku

65 PRINCIP K analyzované látce se pomocí byrety postupně přidává roztok o známé koncentraci, a to tak dlouho, dokud není dosaženo stechiometrického poměru reagujících látek (= bod ekvivalence) bod ekvivalence = reagující látky jsou ve stechiometrickém poměru daném chemickou rovnicí popisující probíhající reakci

66 Odměrný roztok (OR) známé, přesně definované složení jeho koncentraci lze přesně stanovit pomocí stadardu o známé a neměnné koncentraci reaguje se stanovovanou látkou rychle, bez vedlejších reakcí reakci lze popsat chemickou rovnicí v bodě ekvivalence dochází „skokem“ k fyzikálně-chemické změně, kterou je možno snadno indikovat

67 Zjištění přesné koncentrace OR titrací standardu o přesně známé koncentraci porovnání teoretické (předpokládané, vypočítané) spotřeby se skutečnou (aktuální, titrací zjištěnou): V t / V a = f f = faktor odměrného roztoku (0,900 – 1,100) aktuální konc. OR (= titr):c a = f x c t faktorem při výpočtu koncentrace vzorku násobíme teoretickou hodnotu koncentrace OR

68 Výpočet koncentrace vzorku založen na znalosti stechiometrie chemické reakce a A + b B → c C + d D a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n) A = „odměrný roztok“, B = analyzovaná látka a / b = n(A) / n(B)

69 c = n / V→n = c x V c = molární koncentrace (mol/l) n = látkové množství (mol) V = objem roztoku a, b = stechiometrické koeficienty a x n(B) = b x n(A) a x c B x V B = b x c A x V A

70 známe stechiometrii chemické reakce známe koncentraci odměrného roztoku a jeho objem spotřebovaný při dosažení bodu ekvivalence známe objem vzorku použitého pro analýzu jediná neznámá je koncentrace vzorku cBcB

71 Cvičení 1) spotřeba odměrného roztoku: 23,8 ml NaOH, (f = 0,9685; C = 0,1M), vzorek = 10ml H 2 SO 4 ; C = ? 2) spotřeba odměrného roztoku: 10ml KMnO 4 (0,1M), vzorek: 20ml FeSO 4 ; C = ? (mol/ L, % ), MW = 152g 3) H 3 PO 4 → Na 2 HPO 4 vzorek: 20ml H 3 PO 4 (C = 0,3M ), odměrný roztok: 0,2M NaOH V = ?

72 Titraci provádí jedna osoba: po kapkách přidává OR z byrety za stálého promíchávání obsahu titrační baňky

73 Indikace bodu ekvivalence 1)pomocí indikátoru  jednoduché, ale subjektivní hodnocení  bod ekvivalence  objemu OR po jehož přidání změní titrovaný roztok trvale své zbarvení  indikuje „první nadbytečnou kapku“ přidaného OR  ve skutečnosti je při změně zbarvení roztok „přetitrován“ 2)pomocí přístroje (např. potenciometru)  objektivní  vyhodnocuje se TITRAČNÍ KŘIVKA

74 Titrační křivka titrace kyseliny hydroxidem odměrný roztok indikátory měřená veličina

75 titrace hydroxidu kyselinou odměrný roztok

76 Klasifikace titrací 1)neutralizační (acidobazické) kyselina /báze H + + OH - → H 2 O 2)oxidačně-redukční (redox) ox./red. činidlo oxidace: red → ox + e - redukce: ox → red + e - 3)srážecí př. AgNO 3 vznik nerozpustné sraženiny 4)komplexometrické př. EDTA vznik koordinačně-kovalentní sloučeniny

77 Titrace v praktickém cvičení „Stanovení acidity žaludeční šťávy“ reaguje HCl ze žaludeční šťávy odměrný roztok: NaOH → neutralizační titrace (= alkalimetrie) indikátor: fenolftalein (bezbarvý → fialový) z konc. HCl se vypočítá pH žaludeční šťávy zjišťuje se pH před a po stimulaci (= na lačno a „po jídle“)

78 Návody na praktika + teorie metod: viz. Studium / praktika


Stáhnout ppt "Analytické metody Vladimíra Kvasnicová. 1.SPEKTROFOTOMETRIE 2.CHROMATOGRAFIE 3.POTENCIOMETRIE 4.VOLUMETRIE."

Podobné prezentace


Reklamy Google