Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Protoplasty 1971 1971 - 1. normální rostlina z protoplastu - tabák 1972 1972 - fúze protoplastů N. glauca X N. langsdorfii Význam: Význam: teoretický –

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Protoplasty 1971 1971 - 1. normální rostlina z protoplastu - tabák 1972 1972 - fúze protoplastů N. glauca X N. langsdorfii Význam: Význam: teoretický –"— Transkript prezentace:

1 Protoplasty normální rostlina z protoplastu - tabák fúze protoplastů N. glauca X N. langsdorfii Význam: Význam: teoretický – regenerace rostlin; interakce vzdálených genomů praktický – zlepšení vlastností kulturních rostlin Výchozí materiál pro fúzi: Výchozí materiál pro fúzi: protoplastové kultury velké množství rostlinných druhů protoplast  rostlina (i hospodářsky významné – brambor, rajče, tabák, vojtěška … i obilniny a dřeviny) Rozhoduje:  genotyp  typ pletiva, vývojová fáze rostliny výchozí materiál - výhodné in vitro rostoucí, mladé rostliny, mladá pletiva, kořenové špičky, dělohy, vzrostné vrcholy)  suspenzní kultury - exponenciální fáze Solanum verrucosum Greplová, Habásko, 2008

2 Izolace protoplastů Protoplasty  mechanicky – hypertonický roztok, narušení buněčné stěny (1892)  chemicky – působením enzymů (1960) buněčná stěna – polysacharidy, celulóza, pektiny  celulázy, hemicelulázy, pektinázy !! Rozdíly ve stavbě b. stěny jedno- a dvouděložných rostlin – dvouděložné hodně pektinových látek Podmínky – teplota 25-30°C, pH  6, tma, mírné třepání, 30 mi.. 20h Enzymatické působení: dvoukrokové, jednokrokové listy, hypokotyl: 1 % celulasa (Onozuka R 10) 0,25 % pektináza (macerozym R 10) kalus: 2% celulasa (Onozuka R 10) 1% pektináza (macerozym R 10) Př.:Okurka Osmotikum – glukóza, sacharóza, manitol, sorbitol (10-20% roztoky)

3 Čištění Čištění – odstranění enzymů, odstranění zbytků buněk, buněčných stěn, … filtrace, centrifugace, promývání …. Kultivace  inkubační médium nahrazeno kultivačním médiem (ne NH 4 +,  Fe, Zn,  Ca)  citlivý proces – různé způsoby uspořádání (společná kultivace s rychle rostoucími protoplasty), tma, medium s auxiny a cytokininy  na agaru,  agaróze,  agarových bločcích v tekutém médiu,  v kapkách tekutého média,  imobilizace v alginátu,  „nurse cultures“

4 Protoplasty Regenerace protoplastů  regenerace buněčné stěny (2-3 dny)  1. buněčné dělení (2-7 dní)  vytvoření kalusu (tkáňové kultury 3 týdny) Optimální podmínky se liší pro různé genotypy světlo - nevyžadováno, někdy citlivost ke světlu, později stálé světlo luxů, teplota 25-30°C, Spontánní proces -- různá schopnost regenerace u protoplastů z různých pletiv - dobrou regenerační schopnost vykazují protoplasty z mezofylových nebo hypokotylových buněk V průběhu regenerace postupně snižovat obsah osmotika  Organogeneze -přenesení na medium s růstovými regulátory.

5 Protoplastová fúze Protoplastová fúze- somatická hybridizace Metoda kombinace genomů, která obchází sexuální inkompatibilitu Neexistence barier pro fúzi protoplastů Kombinace genomů i cytoplazmy (cybridi) Fúze protoplastů  fúze jader  regenerace buněčné stěny  buněčné dělení  tkáňová kultura  regenerace rostliny cestou organogeneze nebo somatické embryogeneze  Využití pro křížení sexuálně inkompatibilních druhů, sterilních nebo subfertilních druhů, druhů s přirozeně dlouhým životním cyklem Mezirodové a mezidruhové křížení, kombinace jak jaderného, tak mimojaderného materiálu

6 Chemicky indukovaná fúze Protoplasty nesou na povrchu záporný náboj, je třeba použít fuzogeny : PEG, Ca 2+,  pH, 37°C, (výtěžek  1-2% fuzantů) AB + A PEG B AB AB A B Elektrofúze Působení elektrickým proudem (výtěžek  10 % fuzantů) Protoplasty jsou polarizovány střídavým proudem fúze indukována krátkým pulzem stejnosměrného proudu Využití barevnosti protoplastů, rezistence k určitým podmínkám.. Vzniká mnoho typů fuzantů  problém výběru žádané kombinace A + BAB A AA AB A B ++++ Protoplastová fúze rezistentní Vznikají amfidiploidi – diploidní jak mateřský, tak otcovský genom A B

7 Výběr vhodných fuzantů AB + Chlorofyl - A B A B + Chlorofyl - A B Tvar listů Petunia sp Impatiens neuguinea

8 Výběr vhodných fuzantů AB + Chlorofyl - A B A B + Chlorofyl - A B A B + Resistence k antibiotikům, herbicidům, AK analogům, toxickým látkám A B AB + Mezofyl Okvětní lístky A B Tvar listů Nitrátreduktáza - Petunia sp Impatiens neuguinea „Označení“ fluorescenční barvou.. „Verifikace a charakterizace somatických hybridů: morfologické znaky, analýza izoenzymů, chromozomální charakteristika, molekulární techniky

9 Protoplastová fúze Subprotoplasty Subprotoplasty (centrifugace) Subprotoplasty: a) velké, lehké, bezjaderné, s vakuolou cytoplasty  bezjaderné protoplasty  vakuoplasty miniprotoplasty  nukleoplasty  karyoplasty b) malé, těžké, jádro obsahující miniprotoplasty  nukleoplasty  karyoplasty b a a)bez jádra, a tedy neschopné samostatné existence, využití – partneři pro různé typy fúzí b)málo cytoplasmy, ale plastom i chondriom řádně zastoupeny, vysoká metabolická aktivita, syntéza proteinů  jsou zcela životaschopné, zvětšují se, regenerují stěnu a dělí se. + Kombinace jader + Kombinace jader jednoho typu s cytoplazmou druhého Výhoda : po fúzi lze směs opět rozdělit centrifugací jádro valuola chloroplasty jádro

10 + ++ fúze +++ Dělení směsi protoplastů po fúzi Další využití :  karyoplasty - vhodné pro mikroinjekci  karyoplasty - výhodné při selekci na auxotrofii – rychlé vyčerpání poolu  karyoplasty – slouží ke studiu tvorby a vývoje vakuoly Protoplasty- protoplastová fúze

11 Stabilita somatických hybridů: Čím vzdálenější genotypy byly použity, tím menší je stabilita hybridů  nepřežívají  dochází k eliminaci jednoho z genomů  vnitrobuněčná transgenoze  ale !! kde není stabilní kombinace jaderného materiálu - může být stabilní kombinace chloroplastů a mitochondrií Př.: Jádro Petunia eliminováno, kombinace cytoplazmy stabilní Nicotiana Petunia x Př.: Chloroplasty rezistentní ke streptomycinu, jádro zničeno  - zářením x  - záření streptomycin

12 Potenciál somatické hybridizace  Hybridizace s cílem získání určitého znaku  Produkce mezidruhových a mezirodových kříženců (kulturní odrůdy rýže x s divokými druhy; rajče X brambor) Rezistence k chorobám (Brassicaceae, Solanaceae; brambor rezistence – Phytophtora) Rezistence k abiotickým stresům (Fabaceae, Brassicaceceae, Poaceae, Solanaceae, odolnost k nízkým teplotám) Kvalita plodiny (Brassica napus X Eruca sativa,  kys eruková)) Přenos cytoplasmatických znaků (samčí sterility, rezistence k herbicidům a antibitikům)  Produkce autotetraploidů  Produkce fertilních diploidů/ polyploidů ze sterilních haploidů, triploidů nebo aneuploidů  Hybridizace rostlin v juvenilní fázi

13 Limitace somatické hybridizace  nezvládnutá regenerace rostlin z protoplastů  nedostatek vhodné selekční metody pro výběr fuzantů  regenerovaný rostlinný materiál není životaschopný  vývoj chimérických kalusů…(díky výskytu nefúzovaných jader) … pak ztráta chimérického charakteru při organogenezi  regenerované produkty jsou variabilní díky somaklonální variabilitě  mezirodoví hybridi jsou sterilní


Stáhnout ppt "Protoplasty 1971 1971 - 1. normální rostlina z protoplastu - tabák 1972 1972 - fúze protoplastů N. glauca X N. langsdorfii Význam: Význam: teoretický –"

Podobné prezentace


Reklamy Google