Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

MORFOGENEZE Organogeneze, somatická embryogeneze Regenerace nového prýtu: restitucí reprodukcí regenerací de novo (Organogeneze, somatická embryogeneze)

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "MORFOGENEZE Organogeneze, somatická embryogeneze Regenerace nového prýtu: restitucí reprodukcí regenerací de novo (Organogeneze, somatická embryogeneze)"— Transkript prezentace:

1 MORFOGENEZE Organogeneze, somatická embryogeneze Regenerace nového prýtu: restitucí reprodukcí regenerací de novo (Organogeneze, somatická embryogeneze) 1

2 MORFOGENEZE Organogeneze, somatická embryogeneze Diferenciace, dediferenciace, rediferenciace Regenerace nového prýtu: restitucí reprodukcí regenerací de novo (Organogeneze, somatická embryogeneze) 1

3 ? Představa: Všechny buňky mají jádro  jsou totipotentní  indukce  vytvoření nového jedince Neplatí !!! Totipotence buňky nestačí, je třeba, aby buňka byla kompetentní Proč nejsou všechny buňky kompetentní ?? Proč nejsou všechny buňky kompetentní ?Důvody  genetické  epigenetické  fyziologické Proč postupně nereagují všechny buňky ? ?? Proč postupně nereagují všechny buňky ?  vymizení gradientů  vyčerpání živin  zdroj/sink interakce 2

4 Izolace, poranění změna prostředí Neorganizovaný růst Vytváření meristematických center Nové gradienty Nové vztahy Organizace Organogeneze unipolární struktury Embryogeneze bipolární struktury Rediferenciace Kompetence Determinace Morfogeneze in vitro Izolace explantátu Signál(y) 3 dediferenciace

5 Vztahy dějů při morfogenezi Signál(y) získání kompetence Determinace Kompetence !!! Hlavní problém …. Poznání charakteru příslušných signálů V praxi může být obtížné.. často empirický přístup.. Totipotence x kompetence x indukce x determinace Totipotence Signál(y) 4

6 Izolace, poranění změna prostředí Neorganizovaný růst Vytváření meristematických center Nové gradienty Nové vztahy Organizace Organogeneze unipolární struktury Embryogeneze bipolární struktury Rediferenciace Kompetence Determinace Morfogeneze in vitro Izolace explantátu Signál(y) 1 dediferenciace

7 Navržený model organogeneze in vitro …. Dediferenciace Působení vhodné kombinace podmínek (hormonální rovnováha) Přenos hormonálních signálů Aktivace genů, remodelace chromatinu.. Aktivace pluripotentních genů a vytvoření niky kmenových buněk Zhao et al.,

8 Navržený model organogeneze in vitro …. Dediferenciace Působení vhodné kombinace podmínek (hormonální rovnováha) Přenos hormonálních signálů Aktivace genů, remodelace chromatinu.. Aktivace pluripotentních genů a vytvoření niky kmenových buněk Zhao et al.,

9 Změny ve struktuře chromatinu, epigenetické modifikace Polární transport auxinů, asymetrická distribuce hormonů Rediferenciace Působení vhodné kombinace podmínek (hormonální rovnováha) Aktivace WUS a CLV3 genů Změny v koncentraci a distribuci hormonů Změny ve struktuře chromatinu, epigenetické modifikace Aktivace genů identity orgánů Tvorba orgánů Zhao et al.,

10 Př.: Organogeneze u Arabidopsis thaliana Kořenový explantát (hypokotylový explantát) PreCIM SIM CIM RIM Pupeny Kalus Kořeny Co se děje při získávání kompetence ? Che et al., 2006  Geny up-regulované více než 10x, (230), z nich pak největší zastoupení transkripční faktory, Kompetence  Geny down-regulované více než 10x, (520), mezi nejvíce down regulovanými – peroxidázy, dále proteiny asociované s membránami (chloroplastovou, mitochondriální, ER, Golgi) Determinace Start 4 dny 10 dní X 5

11 Co se děje při determinaci ? Geny s odlišnou expresí od situace X geny s odlišnou expresí od situace a pro jiné složení média ( CIM x SIM x RIM) SIM= médium bohaté na cytokininy  Geny up-regulované (478), ARR, geny GA metabolismu, transkripční faktory, proteiny s chloroplastovou destinací…  Geny down-regulované (397), proteiny s jadernou destinací… RIM  médium bohaté na auxiny  Geny up-regulované (558), proteiny spojené s vývojem buněčných stěn a vodivých pletiv, s transportní aktivitou; peroxidázy…  Geny down-regulované (583), cytokinin oxidáza, proteiny účastníci se metabolismu karotenoidů… CIM  pre CIM  Geny up-regulované (241), geny zahrnuté do remodelingu chromatinu, geny stresové odpovědi…  Geny down-regulované (373), proteázový inhibitor, peroxidázy… 4 dny CIM Che et al.,

12 Izolace, poranění změna prostředí Neorganizovaný růst Vznik meristematických center Nové gradienty Nové vztahy Organizace Organogeneze unipolární struktury Embryogeneze bipolární struktury Rediferenciace Kompetence Determinace Morfogeneze in vitro Izolace explantátu Signál 7

13 Organogeneze Přímá Přímá - vývoj prýtů, resp. kořenů přímo z indukovaných buněk primárního explantátu Nepřímá Nepřímá- odvození kalusu - tkáňové kultury a následně indukce vývoje prýtu resp. kořenů Počáteční fáze- tvorba meristemoidu.. soubor malých izodiametrických buněk, Ø vakuoly, vysoký podíl obsahu jaderného materiálu Unipolární útvar Vliv růstových regulátorů: Vliv růstových regulátorů: auxiny, cytokininy, rozhoduje konečná endogenní rovnováha – interakce počáteční endogenní hladiny a vlivu exogenních růstových regulátorů Velké rozdíly v požadavcích různých genotypů Př: Př: Otočení kalusu vzhledem k médiu v různém čase  vytváření meristemoidů na různých místech kalusu Př: Cytokinin:Auxin Př: Indukce tvorby prýtů X poměr Cytokinin:Auxin  často pozitivní kombinace dvou auxinů či cytokininů  u jehličnanů často stačí pouze aplikace cytokininů  u trav jen nízká hladina cytokininů  u vojtěšky- vysoký poměr A:C při indukci z kalusu Proces lze ovlivnit řadou dalších látek: puriny, pyrimidiny, ABA, polyaminy, etylén.. Passiflora edulis Fernando et al.,

14 Izolace, poranění změna prostředí Neorganizovaný růst Vznik meristematických center Nové gradienty Nové vztahy Organizace Organogeneze unipolární struktury Embryogeneze bipolární struktury Rediferenciace Kompetence Signál Determinace Signál Morfogeneze in vitro Izolace explantátu 9

15 Somatická embryogeneze Embryogeneze  zygota in vivo Somatická embryogeneze in vivo : buňky samičího gametofytu (citrusy-běžně vývoj adventivních embryí, ale dokončený vývoj jen při vtlačení do zárodečného vaku… 1-40 embryí v semeni) in vitro Somatická embryogeneze in vitro : vývoj embryí ze somatických buněk posloupností morfologických změn obdobných těm při vývoji zygotického embrya. U některých rostlin: všechna pletiva, u jiných jen některá pletiva responsivní (mrkev X obilniny, reproduktivní pletiva) Př: Př: 1993… 123 druhů z 56 čeledí a 81 rodů, 1995… 1000 druhů somatická embryogeneze in vitro Použití :  Studium zárodečného vývoje rostlin  Množení rostlin organogenezesomat. embryogeneze Bipolární útvar, izolace od mateřských pletiv Unipolární útvar, spojení s mateřským pletivem 10 Pomerančovník, SE odvozené z jedné buňky, G.Vogel, 2010 ??? Bryophyllum

16 Modelová kultura odvozená z kořene mrkve Vývoj kompetentních buněk  Vývoj kompetentních buněk s kapacitou reagovat na indukční působení (závisí na genotypu, stavu „diferenciace“, poloze buněk v pletivu, vývojové fázi) Indukční fáze + 2,4 D  Indukční fáze + 2,4 D – auxin - 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina Determinační fáze Transformační fáze Iniciační fáze DNA dediferenciace DNA metylace Vzestup obsahu cytoplasmy- „meristematické“ buňky Dělení buněk, embryogenní centra Fáze množení + 2,4 D  Fáze množení (proliferace) + 2,4 D Fáze realizační Ø 2,4 D  Fáze realizační Ø 2,4 D !!! globulárnísrdčitétorpédovitézralé embryo 12

17 4. týden 5. týden 6. týden Kotyledonární stádium 200 μm500 μm 1. týden 2. týden 3. týden Rané somatické embryo Cylindrické stádium Prekotyledonární stádium 150 μm200 μm Př: Př: Somatická embryogeneze smrku ztepilého Proliferace embryogenní kultury Iniciace  Proliferace  Zrání + Desikace  Klíčení Proliferace: 5 µM 2,4-D, 2 µM KIN, 2 µM BAP; Zrání: bez auxinů a cytokininů, 20 µM ABA Zrání somatických embryí 13

18 Jaké vnější podmínky rozhodují ?? Klíčová role  Klíčová role : auxin 1. fáze indukce a množení --- nutná přítomnost auxinu (někdy spolu s cytokininem) 2. Fáze realizační --- nutná ne přítomnost auxinu znovuustavení schopnosti embryogeneze Inhibice syntézy auxinu Degradace auxinu ozářením Př: habituovaná tkáňová kultura Citrus sinensis (soběstačná v produkci auxinu)  inhibice embryogeneze 14 Su et al., 2011

19 Jaké další vnější podmínky působí ??  Inhibice: gibereliny  Pozitivní ovlivnění zrání: ABA  Etylén: inhibice vysokými koncentracemi, stimulace nízkými koncentracemi  Stimulace glykoproteiny uvolňovanými z embryogenních buněk  Zdroj N: NH 4 + podporuje embryogenezi, Su et al., 2011 Embryogenezi lze navodit bez přidání auxinu: Osmotickým stresem Těžkými kovy Poraněním (zygotická embrya - mechanické poškození), ale !!!.. výtěžky jsou výrazně nižší

20 Př: Somatická embryogeneze u fotoautotrofní kultury List mrkve Kalus (cukr) Řapík (cukr) +2,4 D Fotoautotrofní kalus +2,4 D-2,4 D +2,4 D-2,4 D Medium bez cukru Medium s cukrem Ø embryogeneze vývoj embryí ?? Jakou roli hraje cukr ? Zdroj energie a C ? Osmotikum ? Signál ?  CO 2  zvýšení produkce cukru  růst srovnatelný s kontrolou  Ø embryogeneze Př: Helianthus annum : konc. sacharózy: klíčový faktor při indukci: rozhoduje o typu morfogeneze: nízká koncentrace  organogeneze; vysoká koncentrace embryogeneze 15

21 Problémy při pěstování somatických embryí  abnormální embrya X zygotická embrya  předčasné klíčení  vitrifikace  sekundární embryogeneze  ztráta morfogenního potenciálu genetická hypotéza fyziologická hypotéza kompetitivní hypotéza Rychlost ztráty morfogenního potenciálu závisí velmi na genotypu Př: smrk, mrkev: embryogenní kultura bez ztráty potenciálu i několik let růže: kultura ztrácí potenciál již po  třech subkultivacích Kryoprezervace : uchování kultur při nízkých teplotách 16

22 Triticale, Oleszcuk et al., 2004 Pylová embryogeneze – androgeneze Výchozí materiál – izolované prašníky izolovaná (nezralá) pylová zrna 60µm 200µm2,5 mm1,5 cm mikrospory Dělící se buňkyPro-embryoEmbryoRegenerující rostlina 17 Indukční působení - různé typy stresu --- teplotní šok, osmotický šok, hladovění  Vznik haploidních rostlin Stadium vývoje … rozhodující.. většinou ve stadiu dvojjaderného pylu haploidní rostliny (durman)

23 18 Pylová embryogeneze ozimé řepky Smýkalová et al., 2006 kolchicin

24 Indukční působení - různé.. např. předpůsobení nízkými teplotami, vysoké hladiny sacharózy.. různé požadavky na světelné podmínky..  Vznik haploidních rostlin Gynogeneze- možná, ale málo používaná haploidní rostliny (ječmen) Výchozí materiál – izolovaná vajíčka (makrosporangia), Stadium vývoje … časné stádium, před rozkvětem, nesmí dojít k samoopylení, lepší výsledky s vajíčky z postranních větví.. původ somatických embryí různý u různých rostlin: rýže : synergidy; ječmen antipody a vaječná buňka 19

25 Somaklonální variabilita Def. : Fenotypová variabilita genetického nebo epigenetického původu, zejména u rostlin odvozených z buněčných kultur in vitro. …. vysoký výskyt odchylek od původního fenotypu  epigenetické změny Př: kortex stonku list. explantát C + kalus C - kalus tabák 20  genetické změny: změny ploidie, multiplikace genů, změny v uspořádání genů, rozsáhlé i bodové mutace

26 Kultivace neorganisovaně rostoucích buněk – kalus, tkáňová kultura - znamená riziko nebo výhodu získání fenotypově odlišných jedinců Co je příčinou ??  Indukce odchylek abnormálními situacemi při kultivaci  Preexistence odchylek ve výchozím materiálu Epigenetické změny DNA metylace Modifikace histonů Interference siRNA, miRNA metylace C acetylace, metylace, fosforylace, vazba s proteiny, cukry.. řízení metylace DNA Rostliny: modifikace histonů nepřenosné přes meiosi, metylace DNA částečně ano Variabilita mezi jedinci X variabilita buněk jedince ! Antibiotika - kanymycin, hygromycin, cefotaxim… změny metylace ! Miguel a Marum,

27 Sato et al., 2011 Mutanty odvozené díky kultivaci tkáňové kultury in vitro Metabolická dráha syntézy antokyanů Flavonoid 30,50-hydroxyláza (F3050H)- kódující sekvence je nezměněna, výchozí typ: promotor – přítomnost transpozonu, aktivace transpozonu při kultivaci in vitro 22

28 (2n) explantát Prašník, pyl kalus kalus Buněčná kultura (2n) (n) embrya protoplastová kultura DNA inkorporace protoplastová kultura (2n) (n) DNA inkorporace kolchicin izolovaná buňka  klon izolovaná buňka  klon (n) (2n) Protoplastová fúze Organogeneze, somatická embryogeneze (n) (2n) 23

29 embryo Kalus Embryo diferenciace dediferenciace Orgánová kultura Buněčná kultura Protoplastová kultura Orgánová kultura Prašníková kultura semeno Regenerant Somatická embrya 24


Stáhnout ppt "MORFOGENEZE Organogeneze, somatická embryogeneze Regenerace nového prýtu: restitucí reprodukcí regenerací de novo (Organogeneze, somatická embryogeneze)"

Podobné prezentace


Reklamy Google