Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Suspenzní kultury. Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích? Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích?

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Suspenzní kultury. Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích? Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích?"— Transkript prezentace:

1 Suspenzní kultury

2 Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích? Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích?

3 stacionární (můstky, buničitá vata, čedičová vata, polyuretanová pěna, membrány apod.) provzdušňovaná - řepačky - řepačky - klinostaty - klinostaty - míchaná - míchaná - probublávaná - probublávaná

4 Rostou a dělí se několikanásobně rychleji než kultury na pevných médiích Využití: jako experimentální model jako experimentální model K produkci sekundárních metabolitů K produkci sekundárních metabolitů K indukci somaklonální variability a následné selekci K indukci somaklonální variability a následné selekci K mikropropagaci (pod kontrolou genetické stability) K mikropropagaci (pod kontrolou genetické stability)

5 Měření a regulace průběhu procesu v bioreaktorech Během procesu se měří F a FCH činitele: fyzikální: teplota, tlak páry, vody a stlačeného vzduchu, příkon, tvorba a množství pěny, průtok plynů a kapalin fyzikální: teplota, tlak páry, vody a stlačeného vzduchu, příkon, tvorba a množství pěny, průtok plynů a kapalin fyzikálně-chemické: pH, redox potenciál, množství rozpuštěného kyslíku (kyslíková elektroda), chemické činitele (měření koncentrace stimulátorů a inhibitorů růstu nebo tvorby produktů – C, N, P, S, Mg, K, Na, Fe, regulátory růstu, prekursory…, měření koncentrace NH 4 +, Mg 2+, Na +, Ca 2+ PO 4 3- atd. specifickými elektrodami) fyzikálně-chemické: pH, redox potenciál, množství rozpuštěného kyslíku (kyslíková elektroda), chemické činitele (měření koncentrace stimulátorů a inhibitorů růstu nebo tvorby produktů – C, N, P, S, Mg, K, Na, Fe, regulátory růstu, prekursory…, měření koncentrace NH 4 +, Mg 2+, Na +, Ca 2+ PO 4 3- atd. specifickými elektrodami)

6 Možnost ovlivnění tvorby sekundárních metabolitů Elicitory Elicitory –abiotické: např. Methyljasmonát (MeJA), polyethylenglykol (PEG) –Biotické: buněčné stěny bakterií Prekursory Prekursory Adsorbenty Adsorbenty

7 mikropropagace

8 Zařízení pro speciální kultivační režimy (Inkubátory, třepačky, rolery, bioreaktory)

9 Inkubovaná třepačka Amplituda Amplituda otáčky (rpm) otáčky (rpm)

10 Roller Pomalé šetrné otáčení Pomalé šetrné otáčení 5-60 revolution per hour (do 1 rpm) 5-60 revolution per hour (do 1 rpm) jen pro buňky, ulpívající na stěnách nádoby jen pro buňky, ulpívající na stěnách nádoby

11 Kultivační láhev s míchadlem Pro suspenzní kultury Pro suspenzní kultury rpm rpm 1-12 litrů (Techne, Sigma) 1-12 litrů (Techne, Sigma)

12 bioreaktor 20l - Panax ginseng za 8 týdnů 200x Sung Ho Son, Korea

13 Bioreaktory firmy VitroSys Inc. Korea - kapacita 20000litrů (20t) (celkem litrů)

14 Ideální suspenzní kultury Vysoký stupeň separace buněk (+auxiny, Vysoký stupeň separace buněk (+auxiny, - vitamíny) - vitamíny) Homogenní morfologie buněk Homogenní morfologie buněk Zřetelná jádra a hustá základní cytoplazma buněk Zřetelná jádra a hustá základní cytoplazma buněk Malý výskyt diferencovaných pletiv (tracheální elementy) Malý výskyt diferencovaných pletiv (tracheální elementy) Rychlý nástup zdvojení populace (24-72 hod) Rychlý nástup zdvojení populace (24-72 hod) Karyologická stabilita Karyologická stabilita

15 Vznik Z kalusu Z kalusu Z homogenizovaných diferencovaných pletiv Z homogenizovaných diferencovaných pletiv Z protoplastů Z protoplastů

16

17 Inokulace/ rychlost růstu Minimálně 10 3 /ml buněk Minimálně 10 3 /ml buněk 1/10 suspenze v exponenciální fázi se doplní čerstvým médiem 1/10 suspenze v exponenciální fázi se doplní čerstvým médiem Koncentrace sacharidů prodlužuje periodu růstu Koncentrace sacharidů prodlužuje periodu růstu

18 Sledování suspenzních kultur sledování změn pH sledování změn pH spotřeba kyslíku spotřeba kyslíku Vodivost média Vodivost média Růst Růst Životnost Životnost Genetická stabilita Genetická stabilita kontaminace kontaminace

19 Sledování růstu hmotnost buněk (čerstvá a sušina) hmotnost buněk (čerstvá a sušina) Množství buněk (ošetření pektinázou – Bürkerova komůrka) Množství buněk (ošetření pektinázou – Bürkerova komůrka) Podíl objemu buněk a média Podíl objemu buněk a média –(pocket cell volume) 10 min při 100rpm –(sedimented cell volume) 30 min Obsah proteinů nebo RNA (µM na počet buněk) Obsah proteinů nebo RNA (µM na počet buněk) Analýza obrazu Analýza obrazu

20 Počítání buněk v suspenzi Bürkerovu počítací komůrku přikryjte krycím sklíčkem, jehož okraje musí pevně přilnout k podkladu Bürkerovu počítací komůrku přikryjte krycím sklíčkem, jehož okraje musí pevně přilnout k podkladu Pipetou odeberte 10 µ l suspenze buněk a kápněte ji ke hran á m kryc í ho skl í čka po obou stran á ch (tedy 2 x 10 µ l). Pipetou odeberte 10 µ l suspenze buněk a kápněte ji ke hran á m kryc í ho skl í čka po obou stran á ch (tedy 2 x 10 µ l). Vzorek nejprve prohlédněte pod malým zvětšením (objektiv 6x nebo 10x), s nímž vyhledejte mřížku s buňkami. Pak spočtěte buňky pod 20x, popř. 45x zvětšujícím objektivem. Vzorek nejprve prohlédněte pod malým zvětšením (objektiv 6x nebo 10x), s nímž vyhledejte mřížku s buňkami. Pak spočtěte buňky pod 20x, popř. 45x zvětšujícím objektivem. Ze zjištěného údaje vypočtěte buněčnou denzitu. Její hodnotu (d) v počtu buněk na mililitr suspenze udává vzorec: Ze zjištěného údaje vypočtěte buněčnou denzitu. Její hodnotu (d) v počtu buněk na mililitr suspenze udává vzorec: d = p / n kde p - celkový počet vyhodnocených buněk a n - počet malých čtverečků mřížky, na nichž byly buňky počítány. kde p - celkový počet vyhodnocených buněk a n - počet malých čtverečků mřížky, na nichž byly buňky počítány.

21

22 Studium životnosti (viability) suspenzní kultury Mrtvé buňky – prostupnost membrány pro PI, Evans Blue apod. Mrtvé buňky – prostupnost membrány pro PI, Evans Blue apod. Živé buňky – aktivita emzymů Živé buňky – aktivita emzymů –Esterázy (FDA) –Respirační schopnost mitochondrií (tetrazoliové soli)

23 Test viability Tabák BY2 Test viability Tabák BY2 FDA + PI FDA + PI FDA PI

24 Analýza obrazu Yasuomi Ibaraki (2006) Plant Tissue Culture Engineering Yasuomi Ibaraki (2006) Plant Tissue Culture Engineering

25

26 Genetická stabilita Díky rychlému dělení obecně lepší než u kalusových kultur Díky rychlému dělení obecně lepší než u kalusových kultur V případě mikropropagace nutné periodicky prověřovat V případě mikropropagace nutné periodicky prověřovat V případě změn založit kulturu znovu ze základní kultury V případě změn založit kulturu znovu ze základní kultury

27 kontaminace Vzhledem k podmínkám umožňujícím rychlé dělení buněk se rychle rozvíjejí i případné kontaminace, nutno mít pod kontrolou Vzhledem k podmínkám umožňujícím rychlé dělení buněk se rychle rozvíjejí i případné kontaminace, nutno mít pod kontrolou

28 Protoplastové kulury

29 Izolace a kultivace Z listového mezofylu, růstových vrcholů, děloh, hypokotylů, kalusu nebo suspenzní kultury Z listového mezofylu, růstových vrcholů, děloh, hypokotylů, kalusu nebo suspenzní kultury

30 postup Povrchová sterilizace explantátu Povrchová sterilizace explantátu Narušení - odstranění spodní epidermis, přesátí Narušení - odstranění spodní epidermis, přesátí Inkubace v médiu s enzymy (pektinázy, celulázy) Inkubace v médiu s enzymy (pektinázy, celulázy) Promytí promývacím médiem s osmoticky aktivními látkami (glukóza, manitol, sorbitol, sacharóza, xylóza) Promytí promývacím médiem s osmoticky aktivními látkami (glukóza, manitol, sorbitol, sacharóza, xylóza) Kultivace, regenerace buněčné stěny, indukce dělení buněk Kultivace, regenerace buněčné stěny, indukce dělení buněk Tvorba kalusu a regenerace rostlin Tvorba kalusu a regenerace rostlin

31 Čerstvě izolované protoplasty karafiátu (Nakano a Mii, 1992) 30  m 2 měsíce 5 dní

32 1cm 1 měsíc -regenerační medium

33 Regenerované rostliny (D. chinensis)

34 E kalus odvozený ze zralého ZE rýže ( Datta 1992) E suspenze Čerstvě izolované protoplasty

35 Rýže z protoplastové kultury Konverze SE E suspenze


Stáhnout ppt "Suspenzní kultury. Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích? Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích?"

Podobné prezentace


Reklamy Google