Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul1 strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul1 strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například."— Transkript prezentace:

1 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul1 strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice) strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice) neomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií) neomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií) velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně) velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně) je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí biomolekul je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí biomolekul Proč vibrační spektroskopie ?

2 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul2 Výhody vibrační spektroskopie  RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivity po skončení měření).  Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné, suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich struktura v krystalu a v roztoku.  Nenáročné na objem vzorku (cca 10  l pro konvenční RS, 20  l pro IČ).  Rychlá časová škála absorpce i rozptylu (  s)  využití vibrační spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné pomocí fluorescence či NMR.  Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).

3 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul3 Specifické výhody Ramanovy spektroskopie  Voda představuje pro Ramanovu spektroskopii ideální rozpouštědlo (na rozdíl od IČ).  Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, při kterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatické molekuly).  Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm -1, daleká IČ oblast)  Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev).  Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)

4 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul4 Nevýhody vibrační spektroskopie izotopická záměna bodová mutace  Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně kompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodová mutace) modifikací.  Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku (   g/  l) byť v malých objemech.  Jak H 2 O tak i D 2 O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii (na rozdíl od Ramanova rozptylu).  Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).

5 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul5  Pásy ve vibračním spektru představují detailní a jedinečný „otisk prstu“ dané molekuly.  Složité molekuly  vibrační módy a jim příslušející spektrální pásy nemohou být přímo přiřazeny souřadnicím výchylek atomů ani z nich jednoduše vypočítány. nelze  vibrační spektrum nelze použít pro výpočet struktury. nezávislé metody  Vibrační spektrum daného strukturního motivu nemůže sloužit jako „otisk prstu“ této struktury dokud s ní není korelováno pomocí nezávislé metody.  Jako základ pro stanovení takové korelace zpravidla slouží struktury určené pomocí difrakčních nebo NMR metod. normální vibrační mód jednoznačný indikátor (strukturní marker)  Každý pás ve spektru odpovídá vibraci specifické skupiny atomů (tzv. normální vibrační mód) s dobře definovanými geometrickými charakteristikami (délka vazby, vazebné úhly, atd.)  správně přiřazený pás může sloužit jako jednoznačný indikátor (strukturní marker) tohoto strukturního rysu. Vibrační konformační markery

6 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul6 C2’ endo/antiC3’ endo/antiC2’ endo/anti (pyrimidiny) C3’ endo/syn (puriny) B-DNAA-DNAZ-DNA Obrázky skeletu B-DNA, A-DNA, a Z-DNA. Každé vlákno B-DNA a A- DNA obsahuje 20 nukleotidů stejné sekvence. Z-DNA je tvořena alternujícími GC páry. Kanonické struktury DNA

7 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul7 nukleosidovépáteřní Ramanova spektra krystalů A-, B-, a Z-DNA. Označeny jsou nukleosidové a páteřní konformační markery. Spektra kanonických struktur DNA

8 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul8 A·B hybrid B-form A-form A.poly(rA).poly(dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (A·B hybridní struktura) B.poly(dA-dT).poly(dA-dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (B-form) C.poly(dA-dT).poly(dA-dT) vlákno při 75% relativní vlhkosti (A-form) D.poly(rA).poly(dT) vlákno při 75% relativní vlhkosti (A-form) Určení struktury RNA·DNA hybridu v roztoku Ramanova spektra

9 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul9 Interakce poly(rA) s poly(rU) v roztoku Soubor Ramanových spekter série vzorků poly(rA) a poly(rU) s postupně se měnícím poměrem A:U od čistého poly(rU) (červené) k čistému poly(rA) (fialové). Spektra byla normalizována a signál rozpouštědla byl odečten.

10 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul10 Interakce poly(rA) s poly(rU) Výsledky faktorové analýzy aplikované na první derivaci souboru Ramanových spekter směsi poly(rA) s poly(rU) s měnícím se poměrem A:U. faktorová dimenze = 4

11 11 Interakce poly(rA) s poly(rU) Byly identifikovány 4 složky: jednovláknová poly(rU), jednovláknová poly(rA), duplex poly(rA).poly(rU) duplex a triplex poly(rU):poly(rA)*poly(rU) triplex. Byla izolována spektra čistých komponent.

12 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul12 Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS) Mechanismy zesílení  = . E povrchový plasmon

13 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul13 Příklady SERS aktivních povrchů I Příklady SERS aktivních povrchů I zdrsněná elektroda Sanchéz-Cortés et al. Langmuir 17, 1157 (2001) ostrůvkovité filmy

14 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul14 Příklady SERS aktivních povrchů II Příklady SERS aktivních povrchů II kovové koloidy kovové koloidy (připravené chemicky nebo laserovou ablací) vlnová délka (nm)

15 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul15 Laserová ablace Laserová ablace Procházka et al., Anal. Chem. 69, 5103 (1997) Nd/YAG pulzní laser, 1064 nm, opakovací frekvence 10 Hz, délka pulzu 20 ns, 7 ml Ag koloidu je připraveno během 15 minutové ablace Munro et al., Langmuir 11, 3712 (1995) laserová ablace - příprava chemicky čistého koloidu

16 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul16 Příklady SERS aktivních povrchů III Příklady SERS aktivních povrchů III koloidní částice imobilizované na silanizovaných skleněných podložkách

17 PORPHYRIN METALATION IN Ag COLLOIDAL SYSTEMS  FREE BASE PORPHYRINMETALATED PORPHYRIN 5, 10, 15, 20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl) porphyrin (H 2 TMPyP) Ag +

18

19 PORPHYRIN METALATION (Undesirable or desirable effect?) Direct adsorption of free base porphyrin onto the metal surface  PORPHYRIN METALATION Impossible to obtain SERS spectrum of unperturbed free base porphyrin Irreproducibility of spectral measurement Can metalation serve to obtain information about Ag colloid/porphyrin system and porphyrin itself?    Detail investigation and quantitative analysis of metalation process Determination of metalation kinetics as a probe of Ag colloid/porphyrin systems Can we protect porphyrin against metalation? Yes, by appropriate molecular spacer

20 QUANTITATIVE ANALYSIS OF METALATION PROCESS 3. Determination of METALATION KINETICS as a time-dependent fraction of pure metalated porphyrin forms in the original spectra 2. Construction of SERRS spectra of PURE PORPHYRIN FORMS as a linear combination of subspectra 1. FACTOR ANALYSIS (singular value decomposition algorithm) Hanzlíková et al., J. Raman Spectr. 29, 575 (1998)  = 1 - exp (- t /  )

21 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul21 Návrh rychlého DNA sekvenátoru na principu SERS Návrh rychlého DNA sekvenátoru na principu SERS Kneipp et al., Appl. Spectrosc. 60, 322A (2007)

22 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul22 Time-elapsed video image of intermittent light emission recorded from a single silver nanoparticle. The elapsed time between images is 100 ms, and the signal intensities are indicated by gray scales. Single molecule SERS Single molecule SERS „blinking“

23 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul23 Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) Surface Plasmon Resonance (SPR) Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) max of LSPR depends on the size, shape, interparticle spacing, dielectric properties of particles and local environment SERS can detect the presence of particular species and/or their interactions Biosenzory založené na SERS ?

24 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul24 JACS 127, 2264 (2005) Biosenzory založené na SERS ?

25 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul25 Biosenzory založené na SERS ?


Stáhnout ppt "Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul1 strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například."

Podobné prezentace


Reklamy Google