Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Real-time PCR v diagnostice MRD a vývoji metastáz u neuroblastomu Kadlecová J. 1, Kratochvílová A. 1, Ravčuková B 1, Valášková I. 1, Gaillyová R. 1 a Štěrba.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Real-time PCR v diagnostice MRD a vývoji metastáz u neuroblastomu Kadlecová J. 1, Kratochvílová A. 1, Ravčuková B 1, Valášková I. 1, Gaillyová R. 1 a Štěrba."— Transkript prezentace:

1 Real-time PCR v diagnostice MRD a vývoji metastáz u neuroblastomu Kadlecová J. 1, Kratochvílová A. 1, Ravčuková B 1, Valášková I. 1, Gaillyová R. 1 a Štěrba J 2. 1 Oddělení lékařské genetiky, 2 oddělení dětské onkologie FN Brno

2 Neuroblastom Nádor periferního nervového systému Patří mezi nejčastější dětské solidní tumory 8-10% všech pediatrických nádorových onemocnění 40% případů diagnostikováno do 12ti měsíců a 90% do 5ti let věku pacienta Incidence 5-10 nemocných na jeden milion dětí Odvozený od migrujících primitivních buněk neurální lišty autonomního nervového systému Primární ložiska: dřeň nadledvinek, ganglia sympatiku U >50% pacientů v době stanovení diagnosy zjištěny metastáze do ostatních orgánů (časně metastázující) O molekulárním mechanismu růstu, diferenciace a programované smrti NBL je stále velmi málo informací

3 Klinická stádia neuroblastomu Klasifikace podle Evanse (Children´s Cancer Study Group Staging System for Neuroblastoma) n Stadium I n Stadium II n Stadium III n Stadium IV n Stadium IV-S -Ložisko nádoru je vymezeno orgánem,ve kterém nádor vznikl -Nádor se rozšiřuje mimo původní ložisko, ale nepřekračuje střední linii. Mohou být zasaženy regionální lymfatické uzliny v blízkosti nádoru. -Nádor se celkově rozšiřuje za střední linii, jsou zasaženy lymfatické uzliny na obou stranách těla. -Nádor metastázuje do vzdálených orgánů (lymfatické uzliny, kosti a kostní dřeň, játra, kůže). -Zahrnuje stádia I a II u dětí mladších 12 měsíců,s metastázemi v játrech, kůži, kostní dřeni, ale kosti nejsou zasaženy.

4 Prognostické faktory n Věk n Stadium choroby při diagnose n Histopatologický nález n Hladiny biochemických markerů v krvi a moči : k.vanilylmandlová a homovanilinová, ferritin, neurospecifická enoláza, laktátdehydrogenáza, katecholamin a jeho deriváty n Genetické faktory  ploidie buňky, stupeň amplifikace N-myc protoonkogenu  HSRs, delece 1p36(obsahuje gen pro nádorový supresor)  LOH, dmins, úroveň exprese genu pro TH, TRK A a C, GD2 syntetázy, telomerázová aktivita....

5 Genová exprese v buňkách neuroblastomu n Tkáňově specifická exprese – gen TH –GD2 syntetáza n Nádorově specifická exprese – geny MAGE, GAGE Rozdílná genová exprese průběh nemoci příznivý vs. nepříznivý neuroblastom vs. normální tkáň Trk A Trk C molekulární markery Změna úrovně exprese n-myc Trk Bn-myc telomerázová aktivita (hTERT) telomerázová aktivita (hTERT)

6 Klinický význam molekulárních markerů  stanovení diagnósy  sledování průběhu onemocnění (MRD, relaps)  detekci NB buňěk v transplantátu před autologní transplantací  určení prognósy

7  MG TH 299bp Stanovení citlivosti detekce mRNA pro TH Stanovení citlivosti detekce TH mRNA fragmentační analýza (ABI PRISM 310) bb NB bb NB bb NB bb NB Tyrosinhydroxyláza (TH) n 1.enzym dráhy syntézy katecholaminů –katecholaminy důležité neurotransmitery a hormony, regulují vnitřní funkce a motorickou koordinaci jsou sekretovány 98% NB (NB je endokrinně aktivní ) jejich metabolity používány pro sledování průběhu onemocnění – exprese TH genu je regulována tkáňově specificky během neonatálního vývoje a diferenciace n - lokalizace genu TH v oblasti 11p15.5

8 MAGE 1- 6 a GAGE 1-8 n Genové rodiny n Kódují nádorové antigeny n Jejich produkty (vázané na MHC) jsou rozpoznávány cytotoxickými T lymfocyty n Exprimovány širokým spektrem lidských nádorů (NB, melanom, k.plic, žaludku, prsu...) Strategie detekce exprese genů MAGE a GAGE izolace RNA RT-PCR kontrola kvality bMG detekce jednotlivých subtypů MAGE 1-6/ GAGE 1-8 M K- 1,5 % agarózový gel, barveno EtBr

9 GAGE 1-8 K-/genomDNA Real-time PCR : pomocí FRED sond ( fluorescence resonance energy transfer): Hybrid. proba 1: donor (fluorescein) Hybrid proba 2: akceptor (LC RED640, 750) Analýza bodu tání amplifikovaného produktu je přímo závislá na sekvenci analyzovaného produktu MAGE h-  2M Relativní kvantifikace pomocí LightCycleru.(Roche) Koncentrace cílové sekvence (MAGE) je vyjádřena ve vztahu k referenčnímu (housekeeping) genu (beta2-Mikroglobulin). K výpočtu koncentrace cílové sekvence i refernečního genu analyzovaného vzorku je užívána standardní kalibrační křivka. Detekce exprese MAGE1-6/ GAGE1-8 pomocí real-time PCR

10 Neurotrofinové receptory trk A, B a C neurotrofiny a jejich receptory regulují proliferaci, diferenciaci a smrt normálních i neoplastických buněk nervové tkáně tyrosin-kinázové membránové receptory trk A, B, C jsou nezbytné pro vysokou vazebnou afinitu a plnou biologickou funkci neurotrofinů a hrají důležitou roli v biologii a klinickém chování neuroblastomů – vazebný ligand pro trk A receptor je NGF (nerve growth factor), pro trk B receptor : BDNF (brain derived nerotrophic factor, pro trk C receptor : NT-3 (neurotrophin 3)

11 Kvantitativní stanovení transkriptu genu trk A pomocí real-time PCR trk A h-  2M Relativní kvantifikace. Koncentrace cílové sekvence (trk A) je vyjádřena v poměru ke koncentraci referenčního (housekeeping ) genu, např.  2M (  2-Microglobulin gene). K výpočtu koncentrací je užívána standardní kalibrační křivka.

12 Telomerázová aktivita (TA) Telomeráza  multiproteinový komplex – lidská telomerázová reversní transkriptáza (hTERT) – vnitřní RNA řetězec (hTR) – RNA vazebný protein (hTEP1)  podíl na vývoji a progresi maligních nádorů TA  je detekována v obnovujících se a rychle se dělících buňkách (zárodečné a nádorové buňky)  může být zachycena v hyperplastických a jiných než neoplastických tkáních marker proliferace  prognostický marker neuroblastických nádorů, vysoká TA (exprese hTERT) koreluje s agresivním biologickým chováním

13 GD2 syntetáza  téměř všechny tkáně neuroblastomu vysokou úroveň GD2 gangliosidu  normální buňky (ne neurálního původu) minimální nebo nulová hladina GD2 gangliosidu  GD2 syntetáza (  -1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferáza) – klíčová role v biosyntéze GD2 gangliosidu – aktivita koreluje s expresí GD2 na povrchu buněk  senzitivní a specifický molekulární marker pro detekci buněk odvozených od neurální lišty

14 Závěr n Zavedení vysoce citlivé metody real-time PCR k detekci i ke kvantifikaci nádorových markerů umožňuje –odhad rizika vývoje metastáz v čase diagnózy nemoci –prognózu léčebné odpovědi –testování kmenových buněk před autologní transplantací n kombinací více molekulárních markerů s dalšími nezávislými metodami detekce ( imunocytologickými, histologickými) je možno zvýšit detekční možnosti nádorové diagnostiky. Je možno postihnout heterogenitu NB  zvýší se pravděpodobnost záchytu NB

15 Poděkování patří především spolupracovnicím z laboratoře molekulární genetiky OLG Brno a také Dr. S. A Burchill z oddělení dětské onkologie,St.James´s University Hospital, Leeds za laskavé poskytnutí buněčné linie neuroblastomu IMR-32


Stáhnout ppt "Real-time PCR v diagnostice MRD a vývoji metastáz u neuroblastomu Kadlecová J. 1, Kratochvílová A. 1, Ravčuková B 1, Valášková I. 1, Gaillyová R. 1 a Štěrba."

Podobné prezentace


Reklamy Google