Mikroskopická technika

Prezentace na téma: "Mikroskopická technika"— Transkript prezentace:

1 Mikroskopická technika
Vladimír Hampl, Veronika Sacherová, Pavel Němec

2 Co vás tu čeká? Světelná mikroskopie (V. Hampl kol.)
Speciální světelná a elektronová mikroskopie (V. Hampl a kol.) Základy obrazové analýzy (P. Němec a R. Černý) Počítání mikroskopických objektů (V. Sacherová a kol.)

3 Co potřebujete na zápočet?
Minimálně 75% účast na praktiku Odevzdání protokolů vypracovaných během cvičení Nákresy dělejte velké, Kreslete, co vidíte v mikrokopu a ne, co je v naší prezentaci, nestínujte, nešrafujte.

4 Doporučené studijní materiály
Naše webové stránky, kde jsou uvedeny prezentace k přednáškám i odkazy na literaturu:

5 Něco navíc o světelné mikroskopii
Knihy a skripta: Dušan Matis a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF Univerzity Komenského, 1993 Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy Petr Smékal: Experimentální metody biofyziky II, Světelná a elektronová mikroskopie. Skriptum PřF Ostravské Univerzity, 1995 Časopis Vesmír: Mikroskopy, věda, průmysl... 1997/10, str. 576 Mikroskopie (barevná dvojstrana uprostřed časopisu). 2004/3 Jaromír Plášek: Proměny světelné mikroskopie ve 20. století. 2004/3, str. 146 A samozřejmě internet!!! Například stránky firem vyrábějících mikroskopy

6 Světelná mikroskopie

7 Krátký pohled do historie mikroskopování
bratři Janssenové, první mikroskop století A. Leeuwehoek 1847 průmyslová výroba mikroskopů firmou Zeiss 1911 C. Reichert, fluorescenční mikroskop s UV excit. 1932 F. Zernick, fázový kontrast 1955 Nomarski, diferenciální interferenční kontrast 1968 rastrovací tandemový konfokální mikroskop 1978 laserový konfokální rastrovací mikroskop

8 Krátký pohled do historie mikroskopování
Leeuwehoekův mikroskop

9 Krátký pohled do historie mikroskopování
Hookův mikroskop cca 1678

10 Světlo Vlnový model (elektromagnetické vlnění)
Způsoby popisu ve fyzice: Vlnový model (elektromagnetické vlnění) Kvantový model (proud fotonů) Geometrický model (světelný paprsek)

11 Světlo Rychlost (c) Ve vakuu 3 x 108 m/s
Vlnová délka (l) Vzd. mezi odpovídajícími si body sinusoidy Amplituda (A) Největší odchylka sinusoidy od nulové hodnoty Fáze (f) Udává v jaké části sinusoidy se vlnění nachází v urč. časovém úseku Frekvence (f) Počet kmitů za jednotku času

12 Světlo

13 Interference a ohyb (difrakce) světla

14 Interference a ohyb (difrakce) světla

15 Interference a ohyb (difrakce) světla

16 Odraz a lom světla úhel dopadu = úhel odrazu

17 Odraz a lom světla řidší prostředí hustší = lom ke kolmici

18 Odraz a lom světla = lom od kolmice řidší prostředí hustší

19 Čočka Světelné paprsky šířící se z určitého bodu předmětu různými směry a dopadající na čočku se v obrazové rovině sbíhají opět do jednoho bodu a skládají tak ostrý obraz předmětu

20 Čočka čočka Ohnisko (F) Optická osa ohnisková rovina rovina čočky
vzdálenost Ohnisko (F) ohnisková rovina Optická osa rovina čočky

21 Čočka

22  Čočka – vznik obrazu Objektiv předmět mezi F a 2xF Okulár, lupa
Skutečný a převrácený obraz F f  F Zdánlivý obraz Předmět blíže než ohnisko (F) čočky Okulár, lupa

23 Vznik obrazu ve světelném mikroskopu
zdánlivý a zvětšený obraz skutečný, převrácený a zvětšený obraz Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz 

24 Vznik obrazu ve světelném mikroskopu
Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz 

25 Vznik obrazu ve světelném mikroskopu
Fyzikální podstata vzniku obrazu v mikroskopu: Ernst Abbe (1873): poměrně složitá teorie, založená na využití Huygensova principu a interferenci transformovaných světelných vln procházejících preparátem

26 Zvětšení světelného mikroskopu
Zvětšení objektivu x zvětšení okuláru

27 Zvětšení světelného mikroskopu
numerická apertura zvětšení Maximální užitečné zvětšení Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu

28 Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu
Vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body a = 0,61 l/ n x sina l - vlnová délka n – index lomu prostředí před objektivem a - polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu numerická apertura Rozlišovací schopnost lze zvýšit: snížením λ  použití modrého světla (modrý filtr) zvyšováním n   použití imerzního oleje

29 světla Ovlavač intenzity světla Hlavní vypínač

30 Preparát č. 1: Amoeba proteus
Zvětšení:

31 Preparát č. 2: NAKRESLIT!!! Paramecium caudatum
Zvětšení:

32 Typy objektů Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně různé části světelného spektra, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

33 Barvení preparátů Nativní Trvalé možno barvit vitálně Roztěry
Živé buňky – nutno použít vhodný fyziol. roztok (savci a ptáci 0,85%, obojživelníci 0,64%, pufrovaný fyz. roztok PBS...) možno barvit vitálně karmín – potravní vakuoly mitotracker – mitochondrie metylénová modř – odlišení živých a mrtvých bb, živé se neobarví Trvalé Musí se fixovat – proti posmrtným změnám bb a tkání při zachování barvitelnosti denaturací bílkovin se zpevní a zakonzervují bb struktury Roztěry Suchý r. –fixace po zaschnutí (methanol), 2D objekty Vlhký r. – fixace za vlhka (Bouin-Holland, sublimát, aj.), 3D objekty Celkové preparáty Kus tkáně Malý živočich (fix. Alkohol 70-80% či formaldehyd 4% Typy barviv: pH kyselá: eosin, světlá zeleň, kyselý fuchsin, kyselina pikrová zásaditá:metylénová modř, toluidinová modř, bazický fuchsin neutrální: Giemsa-Romanowski, různé formy stříbra objekt barvení motolice a tasemnice:borax-karmín prvoci: Giemsa-Romanowski, protargol, hematoxylin tkáně: hematoxylin-eosin

34 Nativní preparát: Tetrahymena pyriformis karmín
Trvalé preparáty: Tetrahymena pyriformis opálová modř Trypanosoma carassi Giemsa-Romanowski Tritrichomonas foetus Giemsa-Romanowski

35 Trvalé barvení: Suchý roztěr Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus pro barvení Giemsa-Romanowski

36 Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski : Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus Fixáž methanol ´ Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) ´ Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ Po oschnutí pozorování preparátu

37 Preparát č. 3: Trypanosoma sp.

38 Preparát č. 4: Tritrichomonas foetus

39 Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski : Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus Fixáž methanol ´ Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) ´ Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ Po oschnutí pozorování preparátu

40 Preparát č. 5: Tetrahymena pyriformis
Barvení: karmín

41 Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski : Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus Fixáž methanol ´ Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) ´ Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ Po oschnutí pozorování preparátu

42 Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´
Trvalé barvení Giemsa-Romanowski : Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus Fixáž methanol ´ Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) ´ Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ Po oschnutí pozorování preparátu

43 Imerzní olej

44 Imerzní olej Předejdeme ztrátám světla
Do objektivu dopadne větší množství paprsků Obraz obsahuje víc detailů

45 Imerzní olej

46 Preparát č. 6: NAKRESLIT!!! Tetrahymena pyriformis
Barvení: opálová modř Zvětšení: cytostom řasinkové rýhy vakuola

47 Preparát č. 7: NAKRESLIT!!! Trypanosoma carassi
Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: jádro kinetoplast undulující membrána

48 Preparát č. 8: NAKRESLIT!!! Tritrichomonas foetus
Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: přední bičíky axostyl volný zadní bičík jádro undulující membrána kosta pelta