EFŽ Ekofyziologie přezimování ektotermů

Prezentace na téma: "EFŽ Ekofyziologie přezimování ektotermů"— Transkript prezentace:

1 EFŽ Ekofyziologie přezimování ektotermů
ruměnice pospolná (Pyrrhocoris apterus) České Budějovice, Stromovka, leden 2003  Vladimír Košťál Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav 2009

2 EFŽ EFŽ Environmentální fyziologie živočichů Vladimír Košťál, 2009
Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav

3 EFŽ Teplota teploty v biosféře se pohybují řádově v rozmezí od -80 do +80 °C životní procesy jsou podmíněny přítomností vody v kapalné fázi (teoreticky 0 až 100C) teplota přímo ovlivňuje celou řadu biofyzikálních a biochemických struktur a procesů: - rozpustnost plynů ve vodě - iontovou disociaci molekul a pH - rychlost pohybu (energii) molekul - prostorovou konformaci molekul - tekutost a fázi biologických membrán - aktivitu enzymů -  rychlost metabolických drah, fyziologických procesů a životních projevů změny teploty zasahují velké množství "cílových" struktur a procesů zároveň struktury a procesy jsou "naladěny" na určitou optimální teplotu změny teploty v jednotlivých (mikro)-habitatech jsou: - běžné (ale ne všudypřítomné: abysál, litosféra, tropy) - habitatově specifické - často cyklické (denní, sezónní) organismy jsou adaptovány na teplotní proměnlivost jejich habitatů adaptované organismy jsou schopny absolvovat fenotypickou změnu  teplotní aklimaci (aklimatizaci)

4 EFŽ Poškozující účinky teplot mimo optimum tvorba ledových krystalů
pevná fáze vody je neslučitelná s aktivními životními procesy, dochází k zakoncentrování nezmrzlé části roztoku, dosažení až toxických koncentrací, objemové změny mohou překročit mechanické a elastické limity buněk změna optimální konformace proteinů až denaturace zpomalení procesů rozpad polymerů na podjednotky nízkoteplotní denaturace pod ca. -15°C vysokoteplotní denaturace nad ca. 45°C změny vlastností lipidů v biologických membránách narušení optimální "tekutosti" pro funkci integrovaných proteinů neregulované fázové přechody do gelové nebo hexagonální fáze jsou neslučitelné s funkcí membrány narušení elektrochemických potenciálů přes buněčné membrány a epiteliální tkáně desynchronizace metabolických funkcí "uncoupling", "disorder" nedostatek energie ve formě ATP zpomalení až ustávání základních procesů: transkripce DNA, syntézy a degradace proteinů, transportů, komunikace a přenosu signálů nekrotická nebo apoptotická buněčná smrt

5 EFŽ Termální biologie bezobratlých
převažuje poikilotermie a ektotermie relativní homeotermie je možná buď ve stabilním prostředí (moře) nebo díky behaviorální termoregulaci basking = slunění ukrývání – ochlazování velmi účinná strategie: půda na slunci larvy půda ve stínu behaviorální termoregulace nymf P. apterus za letního dne endotermie připadá v úvahu za letu, který vyžaduje velmi rychlý oxidativní metabolismus a naopak je potřeba se efektivně zbavovat přebytečného tepla

6 EFŽ Endotermie super-organismu
při pojetí hnízda (kolonie) hmyzu jako super-organismu, můžeme také uvažovat endotermii: hnízdo marvenců Pogonomyrmex badius (Florida, USA) v hloubce půdy je relativně velmi stálá teplota přemísťováním plodu lze zajistit termoregulaci  optimální teplotu pro vývoj přezimující larvy muchnic březnových (Bibio marci) tvoří kolonie (hnízda), larvy konzumují detrit a produkují exkrementy na nichž se živí bakterie a společně tak produkují teplo ...

7 EFŽ Endotermie super-organismu hnízda termitů mají termoregulační
systém chodeb vzdušných a kanálů ... včelí úly snímané infračervenou kamerou ... který je vzorem futuristických staveb záznam teplot v hnízdě a okolí u dvou druhů včel Apis mellifera (nahoře) Trigona carbonaria (dole)

8 EFŽ Supra-optimální (vysoké) teploty teploty prostředí ?
jak se vyrovnat se zvýšením teploty prostředí ? behaviorální termoregulace evaporace (omezená u malých živočichů) kviescence diapauza biosyntéza termoprotektantů (dosud popsána pouze u molic a mšic) expozice ve vysokých, subletálních teplotách stimuluje akumulaci sorbitolu (myo-inositolu) polyoly chrání proteiny před denaturací teplem up-regulace šokových proteinů (HSPs) - indukčním faktorem jsou chybně složené proteiny nebo částečně denaturované proteiny vliv sorbitolu (tmavé sloupce) na relativní aktivitu dvou enzymů molice Bemisia argentifolii za různých teplot

9 EFŽ Denní oscilace teplot max. letní denní maxima
v některých mikro-habitatech dosahují supra-optimálních teplot: larvy vrtule jablečné (Rhagoletis pomonella) žijí ve dřeni jablek ... ... a v době teplotního maxima syntetizují šokové proteiny max. záznam teploty v průběhu dne - nahoře: vzduch - dole: dřeň jablka na slunci Lopez-Martinez & Denlinger (2008). Physiol. Entomol. 33,

10 EFŽ Sub-optimální (nízké) teploty definice nízkých teplot
Rychlost procesu (vývoj, růst, pohyb ...) minimum optimum maximum hypotermní stav kryotermní stav 20 – 30 °C podchlazený stav ULCIZ promrzlý stav Tělní teplota [°C] m.p. LTT SCP 0°C (Lower Temperature Threshold) SCP, supercooling point reálná teplota krystalizace tělní vody Oblast nízkých teplot začíná pro různé druhy hmyzu (a v různých situacích) na různých hodnotách teploty LTT: tropické druhy: ca °C neaklimované temperátní druhy: ca °C aklimované temperátní a polární druhy: až -0.6°C (m.p.) m.p., melting point rovnovážná teplota tání a krystalizace tělní vody

11 EFŽ Příprava k přezimování začíná v létě AKTIVITA DIAPAUZA HIBERNACE
short day short night 50°N letní slunovrat: 21. června zimní slunovrat: 21. prosince DIAPAUZA HIBERNACE krátký nebo zkracující se den po letním slunovratu je signálem příchodu zimy začíná příprava na zimu sezónní změna fenotypu zkracování délky dne

12 EFŽ Časoměrné systémy sledují délku dne ... Hmyz Savci
laterální neurony suprachiasmatická jádra

13 EFŽ Časoměrné systémy sledují délku dne ... Biologické hodiny Hmyz
Savci biologické hodiny hmyzu a savců mají shodný princip a sdílejí i některé „hodinové geny“ produkty hodinových genů (proteiny) však mohou nabývat různých funkcí u různých druhů

14 ... a ovlivňují výdej důležitých hormonů
EFŽ ... transdukují fotoperiodický signál ... Hmyz Savci melatonin PDF ... a ovlivňují výdej důležitých hormonů podzim - zima juvenilní hormon ekdyson gonádotropiny prolaktin "hormony léta"

15 EFŽ Nedostatek „hormonů léta“ Savci Hmyz způsobí změnu fenotypu
zastavují rozmnožování zastavují rozmnožování hromadí energetické zásoby hromadí energetické zásoby tuková kapénka granule glykogenu svišť Marmota marmota ploštice Pyrrhocoris apterus buňka tukového tělesa zlepšují izolační vrstvu mění srst zlepšují izolační vrstvu mění sílu a kvalitu voskové vrstvy mění chování shání potravu hledají/budují zimní doupata migrují do teplejších oblastí mění chování shání potravu hledají/budují zimní úkryty (migrují do zimovišť)

16 EFŽ Fenotypická změna je komplexní ... Savci Hmyz
je pozorovatelná jako hluboká sezónní změna transkriptómu a proteómu Savci Hmyz sysel Spermophilus lateralis proteiny up-regulované při vstupu do hibernace kukly masařky Sarcophage crassipalpis proteiny up-regulované při vstupu do diapauzy

17 decreasing temperature
EFŽ Fenotypická změna je komplexní ... short days decreasing temperature perception reproducing cold-sensitive animal in summer transduction diapausing cold-hardy animal in winter hormonal milieu gene expression developmental mode cryoprotectants behaviour ice nucleators morphology antifreeze proteins protein activities antioxidants shock proteins metabolism defence systems energy reserves membranes water balance ion homeostasis

18 EFŽ V čem je tedy rozdíl ? Savci Hmyz jsou endotermní
regulují svou tělesnou teplotu po celou zimu je ektotermní nedokáže účinně regulovat svou tělesnou teplotu během zimy průběh tělních teplot u hibernujícího sviště typický záznam zimních teplot vzduchu a v listové hrabance pod lipami (České Budějovice) nastavují "regulátor teploty" v hypotalamických neuronech na nižší, ale nad-nulovou hodnotu tělní teplota sleduje teplotu prostředí a ta často, někdy hluboko a dlouhodobě, klesá pod nulu

19 ! EFŽ Strategie hmyzu pro přežití nízkých teplot
1. Regulovat tělní teplotu na úrovni jedince fyzikálně nemožné (ne-efektivní) na sezónní škále teplot do jisté míry možné na úrovni „super-organismu“ 2. Migrovat velikost těla umožňuje migrace pouze na malé vzdálenosti (vyjímky existují - Danaus) 3. Zůstat aktivní v tepelně pufrovaném prostředí synantropní druhy (opportunistic survival) půda, subniveální biotopy (winter activity) 4. Vstoupit do dormance a tolerovat zchlazení až podchlazení (vyhnout se zmrznutí) (chilling tolerance) (freezing-susceptibility or -avoidance) ! toto jsou dvě nejčastěji uváděné a porovnávané strategie 5. Vstoupit do dormance a tolerovat či regulovat zmrznutí (freezing-tolerance) 6. Vstoupit do dormance a potom (částečně) dehydrovat (protective dehydration) možnost následné vitrifikace, týká se edafonu 7. Rychlá chladová aklimace (rapid cold hardening) ochrana před denní fluktuací teploty

20 EFŽ Sezónní aktivita za nízkých teplot - subnivál
strategie živočichů obývajících teplotně pufrované habitaty (půda) kolonie chvostokoků Ceratophysella sigillata migrující po sněhu v lednu (Švýcarsko, 600 m n.m.) během migrace se páří, živí se na nárůstech řas na odumřelém dřevě (v létě upadají do dormantního stavu)

21 EFŽ Sezónní aktivita za nízkých teplot - mediterán
někteří členovci přesunuli aktivní fázi svého životního cyklu (růst, vývoj, reprodukci) do chladného období roku adaptivní výhodou přesunu aktivní fáze je patrně využití volné niky s nižším tlakem parazitů a predátorů a s dostatkem potravy brouk z čeledi Catopidae (západní a střední Evropa), jehož larvální vývoj probíhá v zimě, imaga prodělávají aestivaci a kladou na podzim živí se saprofágně a nekro- fágně letní podmínky mohou být nepříznivé zatímco zimní jsou relativně permisívní typicky v mediteránních habitatech - desikace - nedostatek potravy - biotický tlak)  zimní aktivita letní dormance, aestivace Boreus sp. (Mecoptera) Chionea sp Triphleba sp. (Diptera) imaga srpice Boreus a více druhů much se páří na sněhu v zimě často jsou imaga bezkřídlá

22 EFŽ Extrémní – polární habitaty navzdory drsnosti klimatických
podmínek a omezenosti zdrojů je druhová diverzita členovců (hmyzu !) za severním polárním kruhem poměrně velká Arktida má mnohem větší druhové bohatství díky spojení s pevninou příklad: za hranicí růstu stromů žije jen v Severní Americe na 2200 druhů hmyzu ! polární kruh = 66° j. nebo s.š. vymezení hranice tundry (a alpinní zóny) = izoterma 10°C nejteplejšího měsíce roku relativní porovnání aspektů polárního klimatu: Arktida Antarktida drsnost nízké teploty a teplotní extrémy velká ještě větší sezónnost rozdíl mezi létem a zimou zřejmá méně zřejmá predikovatelnost dlouhodobá, sezónní dobrá slabší krátkodobá, během léta slabá mizivá zdroje potravy dostupnost, bohatost omezené velmi omezené

23 EFŽ Extrémní – polární habitaty
vymezeny zhruba polárními kruhy (66 s.š. nebo j.š.) přesněji izotermou 10C nejteplejšího měsíce (přibližně hranice růstu stromů) ostrov Jamese Rosse Česká antarktická základna

24 EFŽ Stálá aktivita za nízkých teplot – sub-polární habitaty
v sub-Antarktických suchozemských habitatech je stálá nízká teplota - teploty kolem 0C - větrno - vysoká vlhkost (časté srážky) travnatý Marion Island housenka můry Pringleophaga marioni je klíčovým dekompozitorem (největším herbivorem) sub-antarktického ostrova Marion island (JAR) housenky se vyvíjejí několik let imaga jsou brachypterní housenky tolerují mírné promrznutí SCP je kolem -5°C spodní limit přežívání je necelých -6 °C [C] [uL CO2 / h / mg] obrázek ukazuje: b = prudký pokles metabolismu při teplotě -0.6 °C, který není způsoben mrznutím ale odpovídá vstupu do "chill coma" stavu Tc = peak CO2, který přesně koresponduje s teplotou krystalizace (zvětšení objemu vody při mrznutí  stlačení  vypuzení CO2) střední část = nenulový metabolismus v promrzlém stavu konec = okamžité obnovení metabolismu po vzestupu teploty

25 EFŽ Adaptace na život za polárními kruhy Výběr mikrohabitu
pufrované habitaty pro aktivitu a "letní" ukrývání: půda, travní trsy, ptačí guáno osluněná místa pro "basking„ zimní úkryty – pufrované (pod sněhem) – exponované – překvapivě často je volen exponovaný zimní úkryt s nízkou vrstvou sněhu  zdá se, že krátkost letního období je v mnoha případech větší evoluční překažkou než extrémnost zimních teplot Morfologická přizpůsobení malá velikost melanismus hirsutismus apterygie bezkřídlá moucha Anatalanta aptera žije v ptačím guánu na sub-Antarktických ostrovech

26 EFŽ Antarktický bestiář Rick Lee & Dave Denlinger
bezkřídlá moucha Belgica antarctica žije v guánu kolonií tučňáků larvy se vyvíjí dva roky, imago žije jen několik dnů délka 2-6 mm  největší suchozemský živočich pevninské Antarktidy Rick Lee & Dave Denlinger roztoč Alaskozetes antarcticus se vyvíjí pod kameny 5 – 7 let chvostoskok Cryptopygus antarcticus žije 3 roky parazitické klíště Ixodes uriae saje krev ptáků na obou pólech může hladovět až 11 měsíců, pak tvoří shluky pod kameny v ptačích koloniích

27 EFŽ Polární adaptace životního cyklu Strategie urychleného vývoje
fotoperiodický signál je v polárních zónách silně ovlivněn polárním létem/zimou, členovci žijí v pufrovaných mikrohabitatech (půda, vegetační kryt, subnivál)  sezónní průběh teploty bývá hlavním ignálem pro načasování životního cyklu partenogeneze eliminace nutnosti páření a celého sexuálního chování (vyhledávání partnera) stabilita genomu, který se "osvědčil" v danných podmínkách redukce adultního stádia většinu životního cyklu zabírají nedospělá stádia a stádium imaga bývá velmi efemérní až redukované arktické muchničky (Simulidae) dospělé samičky mají redukované ústní ústrojí vajíčka se vyvíjejí již u farátních imag z larválních zásob častá pathenogeneze Prosimulium ursinum = extrémní případ: dospělá samička se vůbec nelíhne z kukelní schránky, nýbrž umírá a po rozpadu schránky se vajíčka uvolňují do potoků, kde se z nich líhnou partenogenetické larvy příští jaro ... polární léto je krátké a chladné a pouze omezená suma energie je dostupná pro dokončení celého vývojového cyklu  strategie max. urychlení vývoje  strategie rozdělení vývoje do ročních fází oddělených přezimováním Strategie urychleného vývoje akcelerace letního vývoje skupiny charakteristické krátkým vývojem (malé mouchy, mšice) jsou početně zastoupeny u mšic jsou většinou eliminovány letní parteno- genetické generace vivipar a fundatrix rovnou produkují sexuální morfy, které kladou přezimu- jící vajíčka mono-voltinnost zajišťuje, že přezimování je vystaveno vždy stejné, rezistentní vývojové stádium (vajíčko, kukla) imago muchničky Prosimulium sp.

28 EFŽ Polární adaptace životního cyklu
Strategie víceletých životních cyklů velmi častá strategie různých taxonů (roztoči, pavouci, chvostoskoci, hmyz) 2 – 7 leté cykly jsou obvyklé, přezimování je možné ve více (nebo všech) stádiích můra Gynaephora groenlandica arktická můra Gynaephora groenlandica (Grónsko) má až 14 letý cyklus housenky se živí listy arktické zakrslé vrby Salix arctica v létě tráví 60 % času "baskingem" (v noci) a zbytek žírem (v poledne) tolerují zmrznutí i v létě v létě jsou 2/3 populace parazitovány (Hyposoter, Exorista) přezimování housenek: již po slunovratu nastupuje diapauza, migrace do půdy  hypotermie důvody: aktivita parazitů pokles kvality potravy příprava na zimu příprava na zimu: akumulace glycerolu a trehalózy degradace mitochondrií (2 měs.) jarní rekonstituce mitochondrií trvá asi 2 týdny

29 ! EFŽ Strategie hmyzu pro přežití nízkých teplot
1. Regulovat tělní teplotu na úrovni jedince fyzikálně nemožné (ne-efektivní) na sezónní škále teplot do jisté míry možné na úrovni „super-organismu“ 2. Migrovat velikost těla umožňuje migrace pouze na malé vzdálenosti (vyjímky existují - Danaus) 3. Zůstat aktivní v tepelně pufrovaném prostředí synantropní druhy (opportunistic survival) půda, subniveální biotopy (winter activity) 4. Vstoupit do dormance a tolerovat zchlazení až podchlazení (vyhnout se zmrznutí) (chilling tolerance) (freezing-susceptibility or -avoidance) ! toto jsou dvě nejčastěji uváděné a porovnávané strategie 5. Vstoupit do dormance a tolerovat či regulovat zmrznutí (freezing-tolerance) 6. Vstoupit do dormance a potom (částečně) dehydrovat (protective dehydration) možnost následné vitrifikace, týká se edafonu 7. Rychlá chladová aklimace (rapid cold hardening) ochrana před denní fluktuací teploty

30 EFŽ Co se stane s vodou za pod-nulových teplot ?
fázové chování vody ve vodných roztocích tělních tekutin: - hemolymfa - obsah střeva (a jiných lumenů) - intracelulární roztoky homogení nukleace každá molekula vody v ledu tvoří vodíkové můstky se čtyřmi sousedními molekulami (tetrahedrální vazba) a zakládá tak velmi charakteristickou hexagonální strukturu ledových krystalů heterogení nukleace krystalizce je „katalyzována“ přítomností nukleátorů Bod tání (rovnovážný bod mrznutí) nukleátor snížení teploty solut extra-cell. intra-cell. Teplota krystalizace (reálný bod mrznutí) vytvoření ledových krystalků v tělních tekutinách vede k osmotickému odsávání vody z buněk a tím k jejich dehydrataci a smršťování

31 EFŽ Intracelulární zmrznutí = smrt ?
alespoň jeden druh háďátka, Panagrolaimus davidii, přežívá intracelulární zmrznutí obyvatel Antarktických půd mikorklimatické teploty se pohybují od +22*C (letní den) do -45*C (zimní noc) saturace mikroklimatu vodou se pohybuje od 0 do 100% háďátko přežije buď promrzlé (inokulace přes řitní otvor) nebo zcela dehydratované rovněž u izolovaných buněk tukového tělesa larvy vrtule Eurosta solidaginis bylo pozorováno přežití intracelulárního promrznutí ...

32 EFŽ Tvorba ledu – mrznutí Heterogenní nukleace osa a osa c
Led v prostředí jako nukleátor ačkoli led nesnadno proniká přes kutikulu či přes lipidickou membránu (hydrofobní struktury), při kontaktu těla s ledem může dojít k nukleaci a promrznutí tělních tekutin skrze tělní otvory osa a Bakteriální nukleátory lipoproteiny 120 – 180 kDa na povrchu membrány epifytních bakterií Pseudomonas syringae Erwinia herbicola Enterobacter aglomerans rozmístěny v agregacích, jež jsou nutné pro jejich nukleační aktivitu, adaptivní význam pro bakterie – poškození epitelu mrazem, zpřístupnění potravy dostávají se do střeva hmyzu a mohou iniciovat mrznutí obsahu střeva již při teplotách ~ -2°C osa c voda většinou nezačíná mrznout po dosažení rovnovážného bodu mrznutí, který odpovídá bodu tání (melting point, m.p.) hodnota bodu tání je koligativně (přímo úměrně) ovlivněná sumární koncentrací solutů = osmolalitou roztoku: 1 osmol/kg = m.p °K (°C) při teplotách pod m.p. voda zůstává v kapalné (podchlazené) fázi dokud nedojde k heterogenní či homogenní nukleaci ledu homogenní nukleace: spontánní zfomování nadkriticky velkého zárodečného krystalu ledu (při -5°C ~ molekul vody, při -40°C ~ 70 molekul) heterogenní nukleace: zformováni krystalu na vhodném povrchu (katalýza) po zformování zárodečného krystalu nastává jeho explozívní růst a mrznutí okolní vody  SCP, rychlé promrzání za současného uvolnění tepla bod podchlazení (supercooling point, SCP) = reálná teplota krystalizace vody stochastická veličina závislá na objemu vody, nukleátorech a čase Tělu vlastní nukleátory většinou nebyly přesně charakterizovány patrně určité epitopy membránových proteinů a/nebo lipoproteiny

33 EFŽ Anomální chování vody při poklesu teploty molekuly vody
v kapalné vodě kapalná voda má maximální hustotu při teplotě +4ºC ohříváním nad tuto teplotu se hustota vody snižuje (obvyklý jev) zchlazovaním pod tuto teplotu se hustota vody také snižuje (anomální jev) reálná teplota krystalizace vody (tvorby ledu) například v rybníce se příliš neliší od 0ºC, protože rybník je velký, obsahuje mnoho hetero- genních nukleátorů a proto je pravděpodobnost vzniku ledu vysoká (voda tedy nedosahuje podchla- zeného stavu) voda o teplotě 4ºC klesá ke dnu neboť je hustší než voda o teplotě 0ºC. U dna rybníka je vyšší teplota než u hladiny (ledu) destilovanou vodu v menší nádobě můžeme podchladit až na přibližně -15ºC, aniž by vznikal led velmi malé objemy vody (nL a méně) lze podchladit až na teplotu přibližně -40ºC vodu v kapilárních pórech o nanometrových rozměrech se podařilo podchladit až na -110ºC (PNAS 104, 9570, 2007) podchlazená voda se rozpíná až do teploty -63ºC a teprve poté začíná houstnout molekuly vody v hexagonální krystalické mřížce ledu teplota vody u dna zamrzlého rybníka je vyšší než u hladiny (ledu) (Slavíček: Vesmír 87, , 2008)

34 EFŽ Podchlazení vs. promrznutí Voda: Metabolismus:
voda zůstává v kapalném stavu voda v extracelulárních prostorech se mění na led dochází k silné dehydrataci buněk hrozí ztráty vody voda je "konzervována" v ledových krystalech Metabolismus: led brání difůzi kyslíku, anaerobní metabolismus buněk je minimální až nulový = kryobióza aerobní metabolismus se zpomaluje, nikoli však zastavuje jsou např. udržovány transmembránové elektrochemické potenciály transmembránové elektrochemické potenciály zcela disipují metabolismus je relativně aktivní : - vyžaduje přísun energie - vyžaduje koordinaci - je náchylný k poškození metabolismus je v hluboké supresi: - umožňuje šetřit energií - nevyžaduje koordinaci - je odolný vůči poškození

35 EFŽ Bod podchlazení – supercooling point (SCP) podchlazení zmrznutí
strategie -20°C podchlazení -60°C chráněné mikro-habitaty částečně chráněné nechráněné mikro-habitaty 0°C strategie zmrznutí -20°C -60°C (Turnock and Fields, E.J.E. 102, , 2005) meta-analýza bodů podchlazení u ca. 350 druhů hmyzu osa x: 11 habitatů seřazených podle "náročnosti" chladné sezóny (1 = tropy, 11 = kontinentální polární oblasti) osa y: teplota bodu podchlazení (0 až -60°C) korelace mezi teplotní náročností habitatu a hodnotou SCP byla nalezena pouze v případech: strategie podchlazení u druhů zimujících v částečně chráněných nebo nechráněných mikrohabitatech modré čáry vymezují SCP = -20°C na tuto hodnotu může poklesnout SCP u malých druhů hmyzu pouze díky odstranění heterogenních nukleátorů

36 EFŽ Podchlazení – problém s desikací
množství a složení kutikulárních lipidů bývá odlišné u nediapauzních a diapauzních stádií snižuje se podíl osmoticky aktivní, tzv. "volné" vody akumulací hydrofilních polymerů - glykogen (sval, tukové těleso) - hexamerní proteiny (hemolymfa) - LEA proteiny akumulací osmolytů - volné aminokyseliny (prolin) - cukry (trehalóza, glukóza, ...) - polyoly (glycerol, sorbitol, ...) kukly Pieris rapae crucivora (bělásek řepový) bílé sloupce: nediapauzní černé sloupce: diapauzní metabolická suprese vede k zpomalení frekvence dýchání a tedy i k nižším respiračním ztrátám vody Kaneko and Katagiri, 2004 Naturwissenschaften 91, diapauzní kukly P. rapae mají několikrát silnější vrstvu uhlovodíků na povrchu kutikuly: nediapauzní kukly: tloušťka 11 nm diapauzní kukly: tloušťka 195 nm mění se i kvantitativní zastoupení jednotlivých uhlovodíků: diapauzní kukly: 29:0  29:1  31:1 

37 EFŽ Podchlazení – problém s potenciály podchlazení hmyz, přezimující
v podchlazeném stavu musí udržovat iontovou homeostázu Kostal et al., 2004 J. Exp. Biol. 207, Pyrrhocoris apterus vlevo: přežívání imag P. apterus za teploty -5C vpravo: rovnovážné potenciály na membránách tukového tělesa P. apterus za teploty -5C nd. wa non-diapause, warm-accl. d. wa diapause, warm-acclimated d. ca. diapause, cold-acclimated zmrznutí hmyz, přezimující v promrzlém stavu rychle ztrácí elektrochemické potenciály, ale je schopen opět je rychle generovat po "roztání" Na+ Mg++ Kristiansen and Zachariassen, 2001 J. Insect Physiol. 47, K+ Xylophagus cincta

38 EFŽ Podchlazení – problém se stabilitou stavu
většina hmyzu přezimuje v podchlazeném stavu a promrzá až při -15 až -50°C Akumulace Anti-Freeze proteinů (AFPs) Odstranění nukleátorů střevní (bakteriální ?) nukleátory jsou odstraňovány evakuací střeva, typickou pro nástup diapauzy mechanismy sekvestrace dalších (vnitrobuněčných) nukleátorů jsou prakticky neznámé (ostatně jako nukleátory samy) pouhým odstraněním nukleátorů se SCP sníží u mnoha druhů hmyzu na ~ -15 až -25°C (protože vodní kompartmenty jsou malé) podchlazený stav je však meta-stabilní a kdykoli může dojít k homogenní nukleaci (AFP) Stabilizace podchlazeného stavu je nutná snížením mobility vodních molekul, díky zvýšení viskozity po částečné dehydrataci, popřípadě akumulaci osmolytů, relativním zvýšením frakce tzv. "vázané vody" v hydratačních obalech solutů a na hydrofilních površích (membrány, makromolekuly) regulace exprese AFP u Tenebrio molitor teplotou a fotoperiodou sezónní druhy up-regulují AFPs i po vystavení krátkému dni dalšími stimulátory jsou desikace a hladovění

39 EFŽ Anti-Freeze Proteins – AFPs AFPs hmyzu
schema aktivity AFPs a termální hystereze AFPs hmyzu charakteristické repetitivní sekvence nalezeny u ca. 50 druhů hmyzu a také u roztočů, pavouků a stonožek poprvé byly AFPs charakterizovány u polárních ryb (DeVries, 1971) a později také u hmyzu (Duman, 1977) a rostlin schopnost adsorbovat se na povrch zárodečného krystalu a potlačit jeho růst při poklesu teploty pod m.p. v rozsahu ca. 2 až 8°K = termální hystereze brání růstu zárodečného krystalu podle osy c (tvoří se placky) podchlazení stabilizují meta-stabilní podchlazený stav zmrznutí brání rekrystalizaci (spojování menších krystalů do větších)

40 EFŽ Struktura AFPs porovnání krystalové struktury tří různých typů hmyzích AFPs: společné vlastnosti všech tří typů: - repetitivní sekvence - opakující se motivy aminokyselin, ß-listů nebo α-šroubovic - zpevnění disulfidickými můstky a vodíkovými vazbami - „plochý“ povrch na jedné straně: adsorpce na ledový krystal vlevo: Tenebrio molitor (Coleoptera) – opakování motivu 12 aa, typický triplet Thr-Cys-Thr uprostřed: Choristoneura fumiferana (Lepidoptera) – motiv 15 aa s tripletem Thr-X-Thr vpravo: Hypogastrura harvei (Colembolla) – motiv Gly-Gly-X Doucet et al. (2009) Cell. Mol. Life Sci.

41 EFŽ Ice Nucelating Agents - INAs
také: Protein Ice Nucleators (PINs) - nukleátory objeveny u epifytických bakterií (Maki et al., 1974), a později nalezeny rovněž u hmyzu (Duman, 1978) funkční podstata spočívá patrně ve vytváření "matrice", neboli katalytického povrchu, který je vhodný pro uspořádávání molekul vody do krystalové mřížky ledu LÉTO ZIMA kooperativní agregace INAs zvyšuje nukleační aktivitu podchlazení zmrznutí intra-celulární a intra-luminární nukleátory scanning tunneling mikrofoto sezónně syntetizované nukleátory v hemolymfě Yeung et al., 1991 J. Vac. Sci. Technol. B9, Zachariassen, 1980 J. Comp. Physiol. 140, charakterizovány u larev tiplice Tipula trivittata globulární lipoproteiny o sumární velikosti ~ 800 kDa, průměru ~ 135 Ǻ proteinový dimer plus fosfatidylinositol obsahují repetitivní sekvence 16 aminokyselin druhy hmyzu, které spoléhají na strategii promrznutí, je aktivně syntetizují a ukládají v hemolymfě před příchodem chladného období při poklesu teploty nehluboko pod 0°C promrzají

42 EFŽ Podchlazení – koligativní kryoprotektanty
koligativní deprese m.p. a SCP při vysokých koncentracích (> 1 M) m.p.: –1.86C / 1 mol SCP: –2 až –6C / 1 mol Ips acuminatus u glycerolu byly zaznamenány koncentrace až 5 M (460 g / L)  ca. 20 % sušiny je přeměmněno na glycerol (!!!) Gehrken, 1985 J. Insect Physiol. 31,

43 EFŽ Podchlazení – ne-koligativní kryoprotektanty nekoligativní účinky
při nízkých koncentracích (< 1 M) deprese m.p. a SCP je zanedbatelná zimní akumulace sorbitolu a ribitolu v sumární koncentraci < 100 mM u přezimujících ploštic P. apterus u mnoha druhů hmyzu byla pozorována sezónní (zimní) akumulace polyolů v koncentracích < 1 M akumulace většinou dobře koreluje s maximem chladové odolnosti jaký je mechanismus účinku nízkých koncentrací ? (když ne koligativní) Kostal and Simek, 2000 J. Insect Physiol. 46,

44 EFŽ Sezónní akumulace kryoprotektantů
předběžnou podmínkou pro akumulaci je změna metabolismu spojená se vstupem do diapauzy vlastním spouštěčem akumulace je potom vystavení nízké teplotě – chladová aklimace velmi typicky je spouštěcí teplotou 5C Kostal and Slachta, 2001 Acta Soc. Zool. Boh. 65, Spouštěč akumulace polyolů je spouštěna poklesem teploty pod 5C Korelace sumární koncentrace polyolů dobře koreluje s chladovou odolností

45 EFŽ Průkaz nekoligativního účinku 250 ug 500 ug -------------------
injikace polyolů do těla diapauzní ploštice diapause adult (pre-acclimated) změny po injikaci (po 1 dnu): koncentrace polyolů: se zvýšila z 2.5 na 83.1 mOsmol.L-1 (byla dosažena typická zimní hodnota) bod podchlazení (SCP): se nezměnil (zůstal na -18.0°C) (koligativní účinky byly zanedbatelné) přežívání za -14°C/ 3d (chladová odolnost) se zvýšilo z 13.3 % na 41.5 % 250 ug ug 2 uL inj. buffer nekoligativní účinek nízkých koncentrací polyolů byl takto přímo prokázán jakým mechanismem nízké koncentrace polyolů zvyšují chladovou odolnost ? Kostal et al., 2001 Comp. Biochem. Physiol. B130,

46 EFŽ Mechanismus preferenčního vytěsnění
základem je pozorování Hofmeistera z konce 19. století: některé ionty stabilizují proteiny (napomáhají jejich rozpuštění ve vodě) jiné de-stabilizují proteiny (napomáhají jejich vysrážení)  Hofmeistrovy řady solutů: později bylo zjištěno, že přírodní kompatibilní osmolyty a kryoprotektanty často obsahují právě stabilizující funkční skupiny (např. amino-skupiny) mechanismus různého účinku různých solutů zůstával dlouho neobjasněn teprve koncem 20. století bylo navržena hypotéza preferenčního vytěsnění kompatibilních solutů preferenční vytěsnění kryoprotektantů (disacharidy oranžově a prolin černě) z domény proteinu vede k preferenční hydrataci proteinu (N) a stabilizaci jeho funkční konformace hydratačním obalem

47 EFŽ Mechanismus preferenčního vytěsnění A a C) de-stabilizující soluty
B a D) stabilizující A a B) rozmístění molekul solutu C a D) vliv na strukturu proteinu empirická pozorování Timasheffa pomocí dialyzační membrány prokázala, že stabilizující soluty jsou vytěsňovány z okolí proteinu a tím je protein přednostně hydratován de-stabilizing solutes  protein denaturation and aggregation stabilizing solutes  protein preferential hydration  stabilization

48 EFŽ Mechanismus preferenčního vytěsnění
ukázalo se však, že "chemické" mechanismy, jež jsou příčinou vytěsnění, nevysvětlují stabilizační efekt klíč k pochopení principu stabilizace je v termodynamice chování proteinu ve vodných roztocích přídavek osmolytu k nativnímu proteinu ve vodném roztoku vede paradoxně ke zvýšení jeho volné energie podstatné je, že denaturace proteinu chráně- ného osmolytem vyžaduje větší změnu volné energie než denaturace proteinu bez osmolytu Naq Uaq (ΔG1) < Nos Uos (ΔG3) N .... nativní protein U .... unfolded (denaturovaný) protein aq .. aquaeous (vodný) roztok os .. osmolyt ve vodném roztoku ΔG . změna volné energie systému právě rozdíl ve změně volné energie je příčinou "nesnadnější" denaturace proteinu v systému s kryoprotektantem a tím také zvýšené stability proteinu

49 EFŽ Biosyntéza kryoprotektantů nejčastěji se jedná o cukerné polyoly
tedy deriváty glykolýzy: - etylén glykol (2C) - glycerol (3C) - threitol (4C) - ribitol (5C) - sorbitol (6C) - myo-inositol (6C) často také o cukry samotné: - fruktóza (6C) - glukóza (6C) - trehalóza (12C) pravděpodobně i volné aminokyseliny: - prolin glykogenová granule tukové těleso Pyrrhocoris apterus (diapauzní imago) inter-konverze glykogenu a myo-inositolu u sluníček Epilachna sp. během přezimování spouštěčem akumulace cukrů a polyolů je nízká teplota (práh většinou ~ 5°C) cukry a polyoly jsou produkty degradace glykogenu většina druhů hmyzu buduje zásoby glykogenu v tukovém tělese v časných fázích diapauzy tyto zásoby mohou být zcela konvertovány na polyoly během přezimování nízká teplota stimuluje (neznámým způsobem) prudký růst koncentrace cAMP v cytosolu, cAMP aktivuje protein kinázu A (PKA) a ta aktivuje kinázu fosforylázy, kináza aktivuje inaktivní formu b glykogen fosforylázy (GPáza) na aktivní formu a, aktivní forma a GPázy štěpí glykogen a tak produkuje uhlíkové skelety (glukózo-1P), které jsou dále přeměněny na polyoly ...

50 EFŽ Biosyntéza kryoprotektantů
glykolytický metabolismus prochází přestavbou při vstupu do diapauzy tak, aby mohl produkovat polyoly po vystavení chladu diapauzní jedinci za nízkých teplot: Glycogen snížení toku uhlíku k TCA diapause metabolism inhibice aktivity fosfofruktokinázy GPase (a+b) NADPH NADP+ Glucose-1-P aktivizace glykogen fosforylázy za teplot pod 5°C G6P-DH AR NADPH 6-P-Glucono- lactone Glucose-6-P Glucose vyšší aktivita glukózo-6P-dehydrogenázy Fructose-6-P Fructose S O R B I T O L Ribulose Ribose aktivizace pentózového cyklu PFK-1 KR NADPH AR NADPH vyšší produkce NADPH Fructose-1,6-bis-P PoDH NAD+ PoDH NAD+ R I B I T O L vyšší aktivita aldózo reduktázy specifická aktivita ketózo reduktázy CO2 NAD+ snížená aktivita polyol dehydrogenáz (kvůli nedostatku NAD+) TCA cycle ATP NADH biosyntéza a akumulace ribitolu a sorbitolu Kostal et al., 2004 J. Insect Physiol. 50, active metabolism

51 EFŽ Promrznutí – kryoprotektanty
larvy vrtule Eurosta solidaginis přezimují v hálkách na zlatobýlech (Solidago) ve východní Kanadě tolerují promrznutí (tvorbu ledu) v promrzlém stavu (na obr. 12 týdnů při -16°C) vykazují známky anaerobního metabolismu hromadění zplodin anaerobie glycerol glykogen úbytek zdrojů energie sorbitol po vstupu do diapauzy (konec léta) akumulují zásoby glukogenu které s nástupem nízkých teplot postupně konvertují na glycerol a potom sorbitol

52 EFŽ Úloha kryoprotektantů při promrznutí
biosyntéza kryoprotektantů probíhá hlavně již před zmrznutím (chladová aklimace) ale (pomalu) pokračuje i po zmrznutí  anaerobní metabolismus (hromadí se laktát) většina druhů se strategií promrznutí spoléhá buď na inokulaci ledem z vnějšího prostředí nebo na biosyntézu nukleátorů do hemolymfy nutnou podmínkou je rovněž odstranění všech nukleátorů zevntiř buněk nukleátor snížení teploty solut extra-cell. intra-cell. vytvoření ledových krystalků v tělních tekutinách vede k osmotickému odsávání vody z buněk a tím k jejich dehydrataci a smršťování právě schopnost přežít dehydrataci (zakoncentrování solutů) a zároveň zmenšení objemu buňky je kritickou adaptací pro strategii promrznutí množství ledu, které se za danné teploty vytvoří, je vždy koligativně dáno osmolaritou roztoku kryoprotektanty zvyšují osmolaritu roztoku  snižují množství vody dostupné pro krystalizaci  snižují osmotické odsávání vody z buněk  regulují minimální objem buňky a tím brání jejímu mechanickému kolapsu  znižují zakoncentrování iontů v cytosolu a tím předcházejí denaturaci proteinů za danné teploty se v systému voda – kryoprotektant přemění menší množství vody na led než by tomu bylo v systému bez kryoprotektantu

53 EFŽ Promrzání znamená rychlé osmotické změny
vyžaduje předběžnou aktivaci transportních systémů vody, glycerolu (kryoprotektantů) pozorováno např. u larev můry Chilo suppressalis (freeze-tolerantní, -25ºC) podmínkou pro přežití je: - vstup do diapauzy - chladová aklimace -25º / 2 hod zamražení v mediu obsahujícím 0.25 M glycerol akumulace glycerolu aktivace transportů barvení trypanovou modří prozrazuje poškození buněk zmrznutím ne-diapauzní, ne-aklimované akvaporinový kanál je-li blokován HgCl2 (0.2 mM chlorid rtuťnatý) → tkáň odumírá tukové těleso larvy (kontrola bez zásahu) glycerol diapauzní, aklimované voda promrzání je doprovázeno rychlým transportem vody ven z buněk (voda se připojuje ke krystalům ledu) a transportem glycerolu dovnitř buněk (potvrzeno pomocí radioaktivně značených molekul vody a glycerolu) přežití (Izumi et al., 2007: J. Insect Physiol. 53, )

54 EFŽ Biologické membrány – častý cíl poškození vysoká teplota
membrána pracuje téměř jako teploměr – její vlastnosti jsou přímo závislé na teplotě: změna teploty  změna fluidity  funkce proteinů  změna fáze  nefunkčnost proteinů  změna propustnosti základní funkční fází je tekutá fáze liquid crystalline phase (lamellar Lα) vysoká fluidita rychlý laterální pohyb umožňuje změny konformace proteinů vysoká teplota nízká teplota gelová fáze je silně organizovaná gel crystalline phase (lamellar Lß) hefagonální fáze je obrácená reversed phase (HII) nízká fluidita (rigidita) pomalý pohyb proteiny nemohou fungovat rozpad membrány ztáíta funkcí

55 EFŽ Přechod do gelové fáze při nízké teplotě pokles teploty
zvýšení organizovanosti, snížení fluidity, zvýšení laterálního tlaku, omezení funkčnosti proteinů přechod do gelové fáze, vytěsnění proteinů na periférii gelové fáze, nefunkčnost proteinů protože membrány mají velmi různorodé složení v horizontálnímm plánu, dochází ke tvorbě gelové fáze lokálně a potom spolu hraničí dvě fáze, fluidní a gelová na rozhraní obou fází dochází ke ztrátě bariérové funkce membrány prakticky okamžitý přesun iontů a solutů  nevratné poškození buňky integrovaný protein

56 EFŽ Jak zamezit přechodu do gelové fáze ? P
snížením míry uspořádanosti  zvýšením fluidity desaturací MK zvýšením podílu PE zeslabením hydrofóbních interakcí P headgroup C16 C18 změnou podílu cholesterolu (??) ten sice snižuje fluiditu membrány ale snižuje pravděpodobnost jejího přechodu do gelové fáze snížením podílu plasmalogenů ty mají typicky vysoký podíl dlouhých nasycených MK reshuffling zkrácení řetězců MK

57 se současnou dehydratací
EFŽ Pozor na hexagonální fázi ! zvýšení teploty se současnou dehydratací přechod do hexagonální fáze adjustace provedené za účelem zamezení přechodu do gelové fáze zvyšují pravděpodobnost přechodu do hexagonální fáze zejména zvyšování podílu PE s krátkými nenasycenými řetězci MK zvyšuje náchylnost membrány k přechodu do HII fáze

58 EFŽ Aklimační změny ve složení membrán
shora jmenované adjustace membrán byly pozorovány u mnoha ektotermů, včetně hmyzu příklad: HPLC/MS analysis of phospholipid composition in the fruit fly, D. melanogaster HPLC 20,56 quantification MS 758,18 MS/MS fractionation 575: PC 502, 520: C16:0 478, 496: C18:2 PC 16:0/18:2 DG SM PG PC PI PE PS Lyso-PC Lyso-PE Retention time m/z

59 EFŽ Aklimační změny ve složení membrán
výsledky jsou však velmi komplexní a dosud jen z menší části je umíme adaptivně vysvětlovat ... výsledky analýzy fosfolipidů u mušek D. melanogaster aklimovaných ve třech různých teplotách (nahoře) výsledky přežívacího pokusu v 0C (vlevo dole) existuje funkční (kauzální) korelace mezi složením membrány a chladovou odolností ??? jakou část změny chladové odolnosti lze adaptivně vysvětlit pomocí změn ve složení biologických membrán ???

60 EFŽ Homeoviskózní adaptace – základní paradigma empirie hypotéza
u mnoha poikilothermů (od bakterií přes rostliny a hmyz až po ryby) byly pozorovány typické změny ve složení membránových fosfolipidů (PL) po vystavení nízkým teplotám prostředí zároveň byla měřena "fluidita" membrány (sledováním difůze fluorescentních prob)  fluidita byla relativně stabilní za různých teplot poprvé formulována u bakterie Escherichia coli (Sinensky, 1974)  homeoviskózní adaptace (HVA): Aklimační změny, popřípadě evoluční rozdíly, pozorované ve fosfolipidickém složení biologických membrán různých živočichů jsou adaptivní: vedou k udržení konstantní viskozity (fluidity) membrány, jež je požadována pro optimální fungování integrovaných proteinů testování teorie byly provedeny analýzy na obou úrovních: - aklimační (fyziologická) - adaptivní (evoluční) hypotéza více-méně drží dodnes existují však pozorování, která teorii nepodporují postupné úpravy teorie

61 EFŽ Teorie HVA fluidita membrány je evolučně přesně naladěná k normální teplotě těla (prostředí) 20°C fluidity membrán různých živočichů měřené za shodné teploty 20C jsou různé protože jejich membrány jsou různé Tb anisotropie fluorscentních prob DPH (di-fenyl hexatrien) nebo TPA jsou měřítkem "fluidity" membrány fluidity membrán různých živočichů měřené za jejich typických tělních teplot jsou podobné protože různé membrány potřebují podobnou fluiditu pro zajištění funkčnosti integrovaných proteinů

62 HVA  HPA  DPB  LPO teorie
EFŽ HVA  HPA  DPB  LPO teorie protože všechna pozorování nezapadala do HVA, bylo postupně navrženo, že: - význam konkrétní hodnoty fluidity membrány není tak velký, jako význam konkrétní fáze membrány  organismy se snaží udržet (evolučně i fyziologicky) optimální fázi  teorie: Homeo-Phasic Adaptation = HPA kromě nutnosti udržet fluidní fázi je důležité být stále stejně „blízko“ přechodu do hexagonální fáze a zároveň stále stejně „daleko“ od přechodu do gelové fáze přechod do hexagonální fáze je totiž nutný pro normální fungování buňky při všech membránových fůzích (vesikulární transporty, fagocytóza, pinocytóza) přechodně a regulovaně vzniká hexagonální fáze – to je třeba udržet přechod do gelové fáze je považován za nežádoucí a letální – tomu je třeba se vyhnout  organismy se snaží udržet (evolučně i fyziologicky) optimální fázi a vzdálenost od přechodů  teorie: Dynamic Phase Behaviour = DPB (konzervace fázové dynamiky membrány) kromě všeho ostatního (viz shora) je potřeba zachovat zcela určitou náchylnost membránových lipidů k peroxidaci  organismy se snaží udržet (evolučně i fyziologicky) optimální náchylnost k peroxidaci  teorie: Lipid PerOxidation = LPO

63 EFŽ Teorie DPB tato teorie v současnosti asi nejlépe vysvětluje empirická pozorování po zvýšení teploty se membrána dostala příliš „blízko“ přechodu do hexagonální fáze následná aklimace (změna složení) vedla k návratu na původní nastavení ... analogicky pro přechod do gelové fáze změna „nastavení“ po náhlé změně teploty předmětem aklimační změny (evoluční adaptace) je zachování "vzdálenosti" Tb od fázových přechodů

64 EFŽ Teorie LPO nenasycené mastné kyseliny (UFAs) jsou mnohonásobně (5x až 40x) náchylnější k oxidaci vlivem ROS než saturované mastné kyseliny (SFAa) podobně PEs jsou náchylnější než PCs zvýšení obsahu UFAa a PEs (typicky pozorované v chladu) může pomáhat pro zachování zcela určité, fyziologicky vhodné hladiny oxidace mastných kyselin příliš rychlá oxidace = řetězová nekontrolovatelná tvorba lipidových radikálů = poškození membrány příliš pomalá oxidace = nízká hladina oxidovaných produktů MK zpomaluje průběh některých buněčných funkcí (tvorba eikosanoidů, buněčná signalizace, vesikulární provoz, ...) = poškození funkcí buňky Schéma hypotézy: obrázek ukazuje, že míra LPO je u dvou různých organizmů shodná, je-li měřená za typických fyziologických teplot (Tb) jestliže se teplota zvyšuje, míra LPO se zvyšuje (protože vzniká více ROS) jestliže teplota klesá, míra LPO také klesá takže relativně nízká hladina UFAs a PEs za vyššich teplot může chránit membranu před oxidativním poškozením PUFAs a naopak relativně vysoká hladina UFAs a PEs za nižších teplot může pomáhat udržet potřebné buněčné procesy, které vyžadují regulovanou tvorbu lipidových radikálů Tb Tb (Crockett., 2008: J. Comp. Physiol. B178, )

65 EFŽ Membrány promrzajícího hmyzu "water replacement„ hypothesis
membrány promrzajícího hmyzu musí navíc vydržet elastické šoky spojené s dehydratací a musí odolat vzájemnému fůzování při těsném vzájemném přiblížení po dehydrataci pozorujeme podobné aklimační adjustace jako u podchlazených organizmů "water replacement„ hypothesis Crowe et al., 1987 Biochem. J. 242, 1-10 larva mušky Chymomyza costata při mrznutí dochází k dehydrataci buněk a tedy i membrán hlavové části fosfolipidů se mohou příliš přiblížit a membrána přechází do gelové fáze  negativní důsledky trehalóza přesně zapadá do struktury membrány a nahrazuje chybějící molekuly vody ... Kostal et al., 2003 Comp. Biochem. Physiol. B135,

66 EFŽ Trehalóza – Water Replacement Theory - trehalóza + trehalóza
akumulace trehalózy je poměrně typický jev pozorovaný u mnoha dehydratujících organismů Bryant et al., 2001 Seed Sci. Res. 11, 17-25 - trehalóza + trehalóza disacharid dvou glukózových jednotek membrány přecházejí do fázového stavu gelu a mohou vzájemně fůzovat disacharidy udržují fázi membrán tekutou a brání jejich fůzi

67 EFŽ Udržení fluidity zásobních lipidů zásobní formou lipidů jsou
triacylglyceroly (TGs) mastné kyseliny glycerol lipáza TG jejich fluidita je dána podílem nenasycených mastných kyselin (čím více – tím tekutější, olejovitější) fluidita je silně ovlivněná teplotou (čím nižší – tím tužší) pouze fluidní TGs jsou dostupné pro lipázy, jež od nich odštěpují mastné kyseliny chce-li živočich využívat své TGs jako zdroj energie za nízkých teplot - jeho TGs musí být za danné teploty ve fluidním stavu ... fluidita zásobních TGs připravených pro přezimování je typicky vyšší než fluiditita „letních“ TGs analogie s HVA teorií platnou pro membránové fosfolipidy

68 EFŽ Aktivizace anti-oxidačních systémů Racionále:
podrobněji v přednášce "Oxidativní stres" Racionále: při změnách teploty dochází ke změnám vlastností membrány  elektrony mohou "unikat" z řetězce oxidativní fosforylace na vnitřní mitochondriální membráně za vzniku ROS podchlazení organismy přezimující v podchlazeném stavu udržují aktivní metabolismus a tedy stále produkují ROS  musí udržovat / aktivizovat anti-ROS systémy: - superoxid dismutáza - kataláza - glutathion reduktáza - glutathion peroxidáza - glutathion-S-transferázy Aktivizace anti-ROS systémů náhlá změna teploty vede ke zvýšení aktivity anti-ROS systémů spolu s indukcí diapauzy může být anti-ROS systém aktivizován v předstihu zvýšenou tvorbu ROS lze očekávat nejen při snížení teploty, ale zejména při jejím opětovném zvýšení, kdy se prudce zvyšuje rychlost metabolismu, a přitom membrána nemusí být ještě optimálně re-adjustována na rychlou oxidativní fosforylaci zmrznutí organismy přezimující v promrzlém stavu jsou ve velmi hluboké metabolické supresi a jejich metabolismus bývá anaerobní a tedy mají sníženou produkci ROS teoreticky nemusí udržovat / aktivizovat anti-ROS ovšem musí je mít připravené pro okamžik tání a náhlého zvýšení oxidativní respirace

69 EFŽ Aktivizace šokových proteinů - HSPs diapauses at pupal stage
akumulace šokových proteinů po vstupu do diapauzy byla pozorována u řady druhů hmyzu ... a to i za stálé normální teploty 20C !!! například u kukel masařky (Sarcophaga crassipalpis) Hayward et al. (2005). J. Insect Physiol. 51, diapauses at pupal stage zvýšení četnosti mRNA transkriptů Hsp23 a Hsp70 po vstupu do diapauzy (den 6 – 7) přetrvává po celou diapauzu (150 dnů) a mizí až při resumpci vývoje (RE), Hsp90 je downregulován, kognát Hsc70 se nemění (ND = nediapauzní kukly)

70 EFŽ Aktivizace šokových proteinů - HSPs ... ale ne u všech druhů hmyzu
například ne u larev masařky (Lucilia sericata) Tachibana et al. (2005). J. Insect Physiol. 51,

71 EFŽ HSPs – reparace chladového poškození
akumulované šokové proteiny mohou sloužit k reparaci chladového poškození (Sarcophaga crassipalpis) RNAi suprese téměř potlačila expresi genů hsp70 a hsp70 45/1 hour -15/1 day kukly s potlačenou expresí šokových proteinů vykazovaly: nižší odolnost vůči vysokým teplotám nízkým teplotám (bez zmrznutí) Rinehart et al. (2007): PNAS 104,

72 EFŽ Ochrana cytoskeletu za nízkých teplot obecně dochází
mikrofilamenta průměr 5 – 9 nm G-aktin  F-aktin polarizace (plus konec přirůstá) struktura výběžků buněčný kortex pohyb myosinu za nízkých teplot obecně dochází k dezintegraci proteinových polymerů běžná teplota depolymerace různých enzymatických komplexů je kole 0C mikrotubuly průměr ca 25 nm α a  tubulin polarizace (α minus –  plus ) centrozóm organizace buńky mitotické vřeténko pohyb kinesinů (k +) pohyb dyneinů (k -) rozpad vláken tubulinu a aktinu za nízkých teplot byl pozorován u rostlin, a také u homeotermních živočichů poikilotermové (antarktické ryby a obrvenky) rozpadu předcházejí HSPs stabilizují cytoskeleton (a bývají up-regulovány v dormanci) pro hmyz dosud nemáme příliš jasná data ... intermediární filamenta průměr 10 nm heterogenní keratiny, lamininy síťovitá struktura mechanická pevnost

73 EFŽ Depolymerace aktinu
v Malpighických trubicích kukel květilky Delia antiqua, které nebyly v diapauze a nebyly chladově aklimovány byl pozorován rozpad aktinu po vystavení chladu (-20C/12 d) vlevo: barvení trypanovou modří naznačuje, že došlo k poškození membrány (trypanová modř nepro- chází membránou ...) vpravo: barvení F-aktinu pomocí TRITC phalloidinu; je vidět rozptýlené skvny = nesouvislá síť F-aktinu chladová aklimace nediapauzních kukel a také vstup do diapauzy (bez chladové aklimace) vedly ke stabilizaci struktury F-aktinu Kayukawa, Ishikawa (2010)

74 EFŽ Aklimační restrukturace aktinu
ve střevě komára Culex pipens byla pozorována restrukturace aktinu při chladové aklimaci exprese aktinových genů byla silnější v diapauze a po aklimaci docházelo ke zvýšené polymeraci aktinu polymerace postupovala směrem od křížení svalových vláken ND25 non-diapause, 25C D18 diapause, 18C -5C 12h cold-acclimation (Kim et al., J. Insect Physiol. 52, , 2006)

75 EFŽ Dehydratace a RCH Dehydratace Rychlá chladová aklimace
tato strategie byla původně popsána (1994) u kokonů žížal (Lumbricidae) později nalezena i u chvostoskoků patrně je široce rozšířena u půdní mikrofauny, která je charakteristická velmi permeabilní kutikulou pro vodu po vytvoření ledu v půdě je tlak vodní páry nad osmoticky aktivní (volnou) vodou v organismu vyšší než tlak vodní páry nad ledem  voda se odpařuje skrze propustnou kutikulu a připojuje se k ledu  organismus rychle dehydruje (ztrácí až 97 % tělní vody) zároveň se syntetizují kryoprotektanty  roztok uvnitř buněk se zahušťuje a nepromrzá podobnost se strategií zmrznutí s tím rozdílem, že voda se připojuje ke krystalům ledu, které jsou vně organismu krátké vystavení neletální, avšak nízké teplotě zlepšuje následné přežívání ve velmi nízkých (jinak letálních) teplotách popsáno (1987) u masařek Sarcophaga crassipalpis posléze nalezena u velkého množství druhů hmyzu vyskytuje se i u nediapauzních stádií hmyzu (zatímco schopnost komplexní "pomalé" chladové aklimace, na ktyerou se budeme převážně soustřeďovat, je většinou omezena jen na dormantní - diapauzní jedince) Mechanismy akumulace glycerolu prahová teplota pro iniciaci akumulace glycerolu je relativně vysoká (~ 15°C) (zdrojem uhlíku může být β-oxidace mastných kyselin) syntéza HSPs tepelný šok (vystavení subletální vysoké teplotě) poskytuje ochranu před následovným chladovým poškozením, aniž by se akumuloval glycerol,  ochranu poskytují syntetizované HSPs rychlá změna složení membrán otázka je, jak rychle může k restrukturaci docházet ?

76 EFŽ Termální biologie ektotermních obratlovců
podobně jako u bezobratlých, také u terestrických obratlovčích ektotermů převládá poikilotermie avšak plazi mají dobře zvládnutou behaviorální termoregulaci, která je fyziologicky založená na duálním termostatu v hypotalamu (podobně jako u ptáků a savců) termoregulace na ca. 34C u zmije růžkaté (Vipera ammodytes) za různého počasí letního dne: A) zataženo B) střídavě oblačno C) slunečno, horko na slunci vzduch v noře Girons (1980): Tuatara 24, 59-79

77 EFŽ Behaviorální termoregulace plazů pokud se plaz nachází v prostředí
slepýš křehký (Anguis fragilis) vyhledává potravu (žížaly) převážně ráno a večer – tehdy udržuje vyšší teplotu. Po zbytek dne naopak šetří energii za nižší tělní teploty ... pokud se plaz nachází v prostředí s vhodným termálním gradientem, potom může velmi účinně termoregulovat typická preferovaná tělní teplota se pohybuje od 30 do 35C denní a noční prefernece se budou lišit v noci dávají přednost chladnějšímu prostředí s cílem ušetřit metabolickou energii příklady termoregulace několika druhů evropských plazů v laboratorních podmínkách plazi byli umístěni v prostředí s termálním gradientem šedé úsečky značí noc (skotofázi) Girons (1980): Tuatara 24, 59-79

78 EFŽ Geografické limity ektotermie ?
při započtení bezobratlých obývá polární oblasti rozhodně více druhů ektotermů než endotermů obecně platí, že s přibývající zeměpisnou šířkou (a také nadmořskou výškou) ubývá druhová diverzita ovšem toto pravidlo platí jak pro ekto- tak také pro endo-termy některé druhy ektotermů jsou velmi dobře evolučně adaptovány pro přežití za polárními kruhy

79 EFŽ Constrainy hlavních taxonů Ryby Obojživelníci Plazi
obývají teplotně homogení a dobře pufrované habitaty: oceány  moře  jezera a řeky  dočasné tůně tepelná izolace těla je ve vodě téměř nemožná kvůli rychlé výměně tepla vedením především silně prokrvené epitely žaber a trávicího ústrojí jsou a musí být v přímém styku s vodou polární ryby jsou nejlépe adaptovány pro udržení stálé aktivity i za teplot blízkých nule, popřípadě pod nulou temperátní ryby mají dobře vyvinutou sezonalitu zahrnující fotoperiodickou regulaci reprodukce a dormanci neznáme ryby, které by přežívaly promrznutí tělní vody (tedy zamrzlé v ledu ...) Obojživelníci permeabilní pokožka  vazba na vlhké mikrohabitaty  hrozí inokulace ledem  hrozí promrznutí ? tolerance promrznutí byla dosud zjištěna u několika druhů žab (rody Rana a Hyla) a snad také mloků přežití až 14 dnů při -5 až -6°C max. 65 % vody je přeměněno na led ostatní: strategie podchlazení do teplot ca. -1 až -3°C Plazi nepropustná pokožka  možnost přezimování v sušších mikrohabitattech  většinou podchlazení tolerance promrznutí se patrně vyskytuje u některých želv (Terrapene carolina, T. ornata) a jejich mláďat v hnízdě (Chrysemis picta, Emydoidea blandigii, Malaclemys terrapin) a také u ještěrky Lacerta vivipara inokulace ledem přes kloaku, oko, nos a zranění teplotní limity podobné jako u obojživelníků u plazů se zimní dormantní stav nazývá brumace vyhledávání tepelně pufrovaných mikrohabitatů pro přezimování je primární strategií obojživelníků i plazů

80 Polární ryby EFŽ nejlépe prostudovanou skupinou
jsou ostnoploutvé ryby z podřádu Notothenioidei 5 – 8 čeledí: ledovkovití ((Nototheniidae) ledařkovití (Channichthyidae) celkem ca. 43 rodů, 122 druhů pouze 16 druhů tzv. „icefish“

81 EFŽ Jižní polární oceán je oddělen Antarktickou polární frontou (APF)
od ostatních oceánů někdy je hrubě vymezován 60 j.š. AFP – chladnější povrchové vody, které putují směrem na sever od Antarktidy se zde potkávají s teplejšími sub-antarktickými vodami a ponořují se pod ně Jižní oceán tvoří asi 10 % světového oceánu ale žije zde jen asi 1 % druhů ryb (z toho 88 % je endemitních) 35 % všech druhů jsou notothenioidi: - 55 % všech druhů v zóně pod 0°C - až 90 % všech druhů v nejchladnějších zónách rozpad Gondwany, izolace Antarktidy od ostatní pevniny, formování APF evoluce Notothenidů APF je spojena se silným východním proudem tento proud vytváří otáčivé proudy ve Wedelově a Rossově moři při pobřeží větry ženou povrchové vody západně paleoklimatický záznam teploty povrchových vod oceánu ve vysokých jižních šířkách ukazuje setrvalý pokles v průběhu třetihor

82 EFŽ Anti-freeze glykoproteiny - AFGPs
adaptivní radiaci Notothenidů v Jižním oceánu patrně umožnil evoluční vynález AFGPs glukóza N-acetyl glukosamin osmolalita tělních tekutin u Notothenidů je zvýšená na 450 – 600 mOsm.L-1 rovnovážný bod mrznutí je tedy mezi –0.8 až -1.1C teplota Jižního oceánu je však až -1.9C epitel žaber je v přímém kontaktu s vodou i ledovými krystalky  pravděpodobnost promrznutí tělních tekutin je vysoká (celoživotní expozice) podchlazený stav je celoživotně udržován aktivitou AFGPs jejich biosyntéza a obrat stojí značnou energii AFGPs mají schopnost adsorbovat se na povrch zárodečných krystalů ledu a potlačit jejich růst pozorujeme rozdíl mezi rovnovážnými bodem tání a mrznutí = hysterezi termální hystereze je ca. 0.5 až 1.5K

83 EFŽ Konvergentní vývoj AF(G)Ps
AF(G)Ps nejsou výlučnou specialitou Notothenidů ... cod treska flounder platýs sculpin vranka sea raven špičatička smelt koruška herring sleď pout sliznatka wolfish vlkouš AFGPs AFPs – pět strukturních tříd u různých ryb jsou u Antarktických notothenioidů (řád Perciformes) jsou také u Arktických tresek (řád Gadiformes) molekulární sekvence velmi silně naznačují, že u obou skupin ryb se proteiny vyvinuly NEZÁVISLE, z rozdílných proteinů u notothenioidů je parentálním proteinem pankreatický trypsinogen, a k jejich evoluci došlo patrně před ca. 15 až 5 mil. lety, v období chladnutí a zamrzání Antarktického oceánu jde tedy u velmi řídce pozorovaný úkaz evoluční konvergence na molekulární úrovni nejlépe prostudovanou třídou jsou Type I AFPs nalezeny u Arktických platýsů a vranek α-helikální struktura, bohatá alaninem (> 60%) 4 repetitivní sekvence (11-mery), začínající threoninem mechanismus nevazebné interakce mezi proteinem a ledem není zcela jasný

84 EFŽ „Icefish“ nemají hemoglobin (!)
jsou to jediní obratlovci bez hemoglobinu je to adaptace (???) jejich krev je bezbarvá má nízkou kapacitu kyslíku – ca. 0.7% (v/v) (ostatní Notothenidi – ca. 7%) (teplokrevní obratlovci – ca. 20 %) příčinou je delece DNA kódující část genu pro α-globin a celý ß-globin včetně nekódující DNA mezi oběma geny navíc některé druhy ztratily i funkční gen pro myoglobin: JAK s tímhle mohou žít ? jejich srdce je větší a výkonější jejich cévy mají větší průměr jejich cirkulace je rychlejší chladné polární vody jsou dobře nasycené kyslíkem a nízké teploty znamenají pomalý metabollismus

85 EFŽ Další adaptace polárních ryb Adaptace proteinů
podrobně to bylo studováno na příkladech laktát dehydrogenázy a malát dehydrogenázy tyto enzymy mají zhruba podobnou substrátovou afinity a aktivitu u různých druhů ryb, jež obývají habitaty s různou teplotou pozorujeme tedy evoluční teplotní kompenzaci studium molekulární struktury potvrdilo, že relativně malé změny v sekvenci amino- kyselin mají za následek zásadní změny termálního chování proteinů terciární struktura LDH s tmavě vyznačenými regiony, jež jsou podstatné pro konformační mobilitu proteinu. Například záměna alaninu za threonin na pozici 219 ve smyčce βJ-α1G zásadně ovlivní mobilitu celé helix α1G-α2G a tím se z "temperátního" enzymu stane "tropický„. adjustace Km LDH pro pyruvát u několika druhů ryb a jednoho ještěra. Všiměte si, že Km je relativně stálá v rozmezí tělních teplot typických pro jednotlivé druhy (silné části čafr, barevná oblast)

86 EFŽ Aerobní kapacita – rychlost metabolismu
Teplotní kompenzace aerobní kapacity ??? Zmnožení mitochondrií je ale evidentní: NENÍ žádná evoluční kompenzace teplotní závislosti rychlosti klidového metab. na úrovni celého organismu (ačkoli některá data ukazují, že může být ... ???) NENÍ žádná kompenzace ani na úrovni izolovaných mitochondrií: pelagické demersální čím nižší teplota habitatu, tím vyšší je hustota mitochondrií ve svalovém vláknu usedlé (demersální) ryby mají korelaci strmější hustota mitochondrií u antarktických ryb dosahuje 50 % plochy průřezu (tedy max. teor. limitu) kosterní sval savců má hustotu ca. 10%

87 EFŽ Paradoxy vyšší hustoty mitochondrií ZÁVĚR:
rychlý obrat "AFPs" a vysoký počet mitochondrií představují extra-náklady energie protože se ale zároveň nezvyšuje schopnost vyrábět energii (viz výše: ne-kompenzace aerobní kapacity), energie se asi musí někde šetřit – KDE? velký podíl spotřeby energie jde na vrub udržení elektrochemického potenciálu (funkce ATPáz) snížení plochy aktivních povrchů = snížení nákladů antarktické ryby mají velký průřez svalových vláken (100 μm pomalá, 600 μm rychlá) = úspora povrchu  úspora energie ALE, nenasycené lipidy jsou velmi citlivé k peroxidaci, tedy k poškození vyvolanému volnými kyslíkovými radikály (ROS) jež vznikají jako vedlejší produkt oxidativního metabolismu jestliže tedy je mnoho mitochondrií se silně nenasycenými lipidy v membráně, hrozí peroxidace a ve výsledku buněčná smrt naštěstí (?) má nenasycená membrána také zvýšenou difůzní propustnost rovněž pro protony  protonový gradient se snižuje,  rychlost oxidativní fosforylace se snižuje,  produkce ROS se snižuje, (právě vysoký proton leak je pak další příčinou teplotní ne-kompenzace i při relativně vysokém počtu mitochondrií) OVŠEM, velký průřez vláken = horší difůze kyslíku (kyslík je lépe rozpustný v lipidech než v cytosolu) TAKŽE, zmnožení mitochondrií může být spíše adaptací pro účinnější transport kyslíku (???) ZÁVĚR: adaptace antarktických „icefish“ i jiných ryb ukazují na vyšší potřebu kompenzovat intracelulární transport kyslíku (i za cenu zvýšení možnosti poškození tvorbou ROS) spíše než kompenzovat aerobní oxidativní kapacitu na podporu této hypotézy lze dále uvést, že: mitochondrie vytváří retikulární (síťovitou) strukturu vhodnou právě pro přenos kyslíku obsah tuku ve svalových vláknech je vyšší obsah poly-nenasycených mastných kyselin v mitochondriální membráně je značně zvýšený, což obojí opět vede k lepší rozpustnosti kyslíku a k jeho rychlejší difůzi svalovým vláknem

88 EFŽ Sezónní aklimatizace temperátních ryb Reprodukce
většina druhů ryb vykazuje určitý stupeň sezónnosti reprodukčního chování míra sezónnosti se zvyšuje s přibývající zeměpisnou šířkou a tedy s přibývající amplitudou sezónních klimatických výkyvů fotoperioda je hlavním faktorem regulujícím reprodukci ve vyšších zeměpisných šířkách, transdukce fotoperiodického signálu jde patrně přes ovlivnění biosyntézy melatoninu v pineální žláze mozku a přes ovlivnění produkce hypo- talamického faktoru uvolňujícího gonádo- tropní hormony z předního laloku hypofýzy fluktuace teploty mohou ovlivnit genovou expresi a proteinovou aktivitu v kritických bodech endokrinní kaskády reprodukce přehled hierarchie faktorů regulujících reprodukci na ose zeměpisné šířky

89 EFŽ Sezónní aklimatizace temperátních ryb
Kompenzace fyziologických funkcí za snížených teplot indukce exprese „sezónních isozymů“ je poměrně vzácná: postupná chladová aklimace Cyprinus carpio vede k pozastavení transkripce isozymu Cds 1 desaturázy a naopak k up-regulaci isozymu Cds 2 v játrech adaptivním efektem je zřejmě adjustace rovnováhy mezi nenasycenými a nasycenými MK v membránách změny v abundanci proteinů jsou naopak obvyklé imunocytochemická lokalizace NaK ATPázy v žaberních lamelách Cyprinus carpio aklimovaných v nízké (vlevo) a vysoké (vpravo teplotě) v nízká teplotě vidíme mnohem více pump, adaptivním efektem je zřejmě udžení normální funkce za snížené teploty všimněte si také změny morfologie žaberních lamel ...

90 EFŽ Sezónní aklimatizace temperátních ryb Kompenzace aerobní kapacity
Kompenzace produkce energie např. u pstruha (Salmo trutta) tyto změny zahrnují: - zimní zvýšení oxidativní kapacity mitochondrií - vyšší zastoupení poly-nenasycených mastných kyselin (PUFA) v mitochondriální membráně - vyšší densitu záhybů vnitřní mitochondriální membr. - zvýšení obsahu tuku ve svalech výsledkem těchto změn je udržení schopnosti svalu pracovat i za nízkých teplot (i když výkonnost je nižší) např. u kapra vidíme vyšší expresi genů podjednotek ATPsyntázy a cytochrómů za nízkých teplot svalové mitochondrie pstruha v létě (vlevo) a v zimě (vpravo). Viz vyšší hustotu "krist" v zimních mitochondriích

91 EFŽ Sezónní aklimatizace temperátních ryb
v.s. Dormance = úspora energie Kompenzace produkce energie kompenzace fyziologických funkcí není udržitelná za všech podmínek teploty, dostupnosti kyslíku, potravy atd. některé druhy ryb kompenzují jen po určité teplotní prahy a pod nimi již upadají do dormantního stavu: evropský úhoř, Anguilla anguilla při poklesu teploty pod 8ºC přestává přijímat potravu a zahrabává se do bahna americký úhoř, Anguilla rostrata, se chová podobně. Pokusy ukázaly perfektní kompenzaci metabolismu v rozmezí teplot ºC. Naopak žádnou kompenzaci při teplotách pod 10ºC. Metabolická rychlost poklesla s Q10 = 4.1 při poklesu teploty z 10 na 5ºC, což ukazuje na regulovanou metabolickou supresi. podobné závislosti byly zjištěny i u dalších druhů ryb: sumeček americký (Ameiurus nebulosus), halančík Fundulus heteroclitus karasi – extrémní tolerance k anoxii a nízké teplotě adaptivní význam dormance je zřejmý: úspora energie Anguilla anguilla Carrasius carrasius

92 EFŽ Sezónní aklimatizace kapra Analýza transkriptómu kapra
celkem sledováno genů v 7 tkáních při 30°, 23°, 17° a 10°C černá = výchozí stav, červená = up-regulace, zelená = down-regulace Základní odpověď bylo zjištěno celkem 252 up-regulovaných transkriptů, které byly společné pro všech 7 tkání a pouze 8 down-regulovaných transkriptů tento poměr odpovídá základnímu paradigmatu chladové aklimace = za nižších teplot je potřeba kompenzovat úbytek aktivity zvýšením množství (proteinu, enzymu) Geny, jejichž transkripce byla změněna chladem je možno rozdělit do "funkčních" skupin: a) regulace transkripce, sestřihu RNA a translace, struktura a zpracovaní nukleových kyselin (40 genů) b) iontový transport, mitochondriální produkce ATP (37 genů) c) katabolismus proteinů, funkce proteasomů (35 genů) d) odpověď na stres: chaperoning, ROS-scavenging, apoptóza (21 genů) e) intermediární metabolismus včetně desaturace lipidů (18 genů) f) signalizace a přenos informace (13 genů) g) buněčná struktura, stabilita tubulinu (12 genů) h) skupina down-regulavaných genů netvoří žádnou "funkční" skupinu Specifická odpověď dále bylo zjištěno celkem 3201 genů jejichž transkripce je ovlivněna chladem specificky podle jednotlivých tkání aklimace na chlad je: aktivní (upregulace) komplexní (značná část genómu) tkáňově specifická

93 EFŽ Sezónní aklimatizace korušky Koruška (Osmerus mordax)
původní výskyt v pobřežních až brakických vodách severního atlantického pobřeží USA a Kanady introdukovaná do Velkých jezer i jinam (Osmeridae) . délka do 20 cm aktivní i v zimě pod ledem (Ta ~ -1.8°C) živí se garnáty, různonožci (Amphipoda) a mnohoštětinatci (Polychaeta) Akumulace glycerolu Koruška je vyjímečná svou schopností akumulovat velké množství glycerolu ve všech tkáních (jen u třech dalších druhů ryb byla zjištěna podobná schopnost) spouštěčem je pokles teploty pod 5°C (aktivace glykogen fosforylázy b  a) zdrojem C pro počáteční akumulaci je glykogen (glukóza) glycerol velmi rychle přechází do vody (!), což vyžaduje neustálé doplňování zdrojem C pro doplňování hladiny jsou aminokyseliny (z přijaté potravy) glycerol sezónní průběh teploty a akumulace glycerolu v plazmě Osmerus mordax

94 EFŽ Sezónní aklimatizace korušky
akumulace glycerolu vyžaduje adjustaci metabolismu TMAO trimetylamin-oxid, organický osmolyt s kosmotropním účinkem a schopností stabilizovat proteiny při změně teploty zdrojem energie a C-skeletů jsou aminokyseliny z potravy akumulace glycerolu a TMAO vede k sezónnímu zvýšení osmolality  koligativnímu snížení m.p.  oddálení možnosti promrznutí přesto se koruška v zimě nachází v podchlazeném stavu zvýšená transkripce a aktivita enzymů biosyntézy glycerolu: glycerofosfát dehydrogenázy (GPDH) aspartát- a alanin-aminotransferáz (AspAT a AlaAT) fosfoenolpyruvát karboxykinázy (PEPCK) zároveň je akumulován trimetylamin-oxid (TMAO)

95 EFŽ Sezónní aklimatizace korušky Biosyntéza AFPs
sezónní akumulace AFPs v krvi začíná již na podzim (kdy je teplota vody ještě relativně vysoká) spouštěčem je patrně fotoperioda termální hystereze je relativně nízká (ca. 0.25°C) minimální úroveň termální hystereze pozorovaná v plazmě Osmerus mordax v průběhu zimy musí stačit ke stabilizaci podchlazeného stavu a k prevenci promrznutí ve vodě, která dosahuje teplot -1.9C

96 Obojživelníci přežívající promrznutí
EFŽ Obojživelníci přežívající promrznutí Hyla versicolor většina obojživelníků spoléhá na vyhledání vhodného úkrytu, kde je jednak vhodná vlhkost ale zároveň teplota neklesne pod rovnovážný bod tání tělních tekutin (-0.5C) někteří dokáží mírně podchlazovat a přežít za teplot do -1.5C skupina freeze-tolerantních druhů je patrně velmi malá, i když může zahrnovat více druhů, než je nám dnes známo Hyla crucifer Pseudacris triseriata

97 EFŽ Skokan lesní – rekordman promrznutí
skokan lesni (Rana sylvatica) je nejlépe prostudovaným druhem a zároveň nejodolnějším dokáže přežít až 14 dnů za teploty do -6C, kdy může být až 65 % jeho tělní vody přeměneno na led primárním předpokladem je (jako u všech freeze-tolerantních živočichů) zmrznout extracelulárně to zajišťuje led v mikrohabitatu, vysoká permeabilita pokožky a nukleační bakterie na pokožce a ve střevě vznikající led v mimobuněčném prostoru vede k zakoncentrování roztoku a tím pádem k osmotickému odsávání vody z buněk = k částečné dehydrataci buněk zároveň se syntetizuje, distribuuje a ukládá glukóza – kompatibilní osmolyt a kryoprotektant

98 EFŽ Kryoprotektanty žab Rana sylvatica akumulace glukózy
většinou jde o glukózu, pouze u rosničky Rana versicolor byla zaznamenána akumulace glycerolu zdrojem pro biosyntézu kryoprotektantů je glykogen - až 180 mg / g jaterní tkáně mmoles / kg tissue mmoles / L spouštěčem biosyntézy je promrznutí extracelulárních prostorů, receptor této události je neznámý, patrně jde o osmoreceptory v perifériích, transdukce signálu do jaterních buněk je neznámá samotná nízká teplota nestačí ke spuštění biosyntézy rychlá konverze formy b  a glykogen fosforylázy pomalejší celkový nárůst aktivity glykogen fosforylázy  silná hyperglykémie krve (až ca. 500 mM) (normoglykémie: ca. 5 mM) glukóza je rozváděna krevním oběhem a vstupuje do buněk (které se předtím patřičně aklimačně připravily – transportéry glukózy) výsledkem je:  koligativní suprese m.p.  regulace míry dehydratace buněk  regulace minimálního objemu buňky s glukózou se za dané teploty vytvoří méně ledu než bez glukózy

99 Plazi EFŽ obecně platí totéž co pro obojživelníky
Ještěrka živorodá (Lacerta vivipara) patří mezi plazi s nejsevernějším výskytem mírné pásmo Euroasie, výskyt až za polárním kruhem akumuluje glukózu v době přezimování - hodnoty glukózy u podchlazených ještěrek: krevní plazma 15 mM játra 22 mmoles / kg toleruje částečné promrznutí - hodnoty glukózy u promrzlých ještěrek: krevní plazma 22 mM játra 54 mmoles / Kg je otázkou, nakolik mírná hyperglykémie pozorovaná u plazů může skutečně ovlivnit úspěch přezimování koligativní působení je zcela zanedbatelné nekoligativní působení může zahrnovat jak zadržování vody tak také účinky na konformaci proteinů a membrán normoglykémie plazů je 6 – 7 mM (plazma)

100 Želvy EFŽ Želva ozdobná (Chrysemis picta ... ... bellii (East)
... marginata (West) čerstvě vylíhnuté želvičky v podchlazeném stavu snáší teploty až -12°C v promrzlém stavu snáší teploty až -4°C akumulují glukózu v plazmě: mM video “tání“ zmrzlých želviček na adrese: Glukóza je nejčastějším kryoprotektantem obratlovců výhody: má koligativní účinky na m.p. a SCP je to fermentovatelný substrát i za hypo- a anoxie má energeticky nenáročný metabolismus (nevyžaduje ATP pro uvolnění z glykogenu) je možná její rekonverze zpět na glykogen nevýhody: je to redukující cukr způsobuje glykaci (a tím poškození) proteinů belli marginata výskyt želvy ozdobné na větš. území USA a na jihu kanady

101 EFŽ Další fyziologické adjustace plazů
Ochrana proti zvýšeným koncentracím ROS zejména za situací, kdy je zásobení tkání kyslíkem variabilní (mrznutí/tání, dočasné zaplavení, střídání teplot) je zvýšená tvorba ROS velkou hrozbou (náhlé zvýšení oxidace vzdušným kyslíkem musí být kompenzovánou dostatečnou kapacitou anti-ROS systémů) pozorujeme vysoké aktivity enzymů - superoxid dismutázy, - glutathion transferázy, proteinů - thioredoxin metabolitů - askorbát, - glutathion upregulace proteinů, které vážou železo - ferritin uvnitř buněk - transferin v plazmě je patrně součástí systému ochrany před ROS, protože volné ionty Fe++ by se jinak účastnily Fentonovy reakce za vzniku hydroxylových radikálů Změny metabolismu pro zajištění anaerobie týká se těch, kteří mohou být zaplaveni nebo mohou zmrznout aktivace glykogenolýzy nízkou teplotou (transdukce: PKA, HIF-1, MAPK) produkce glukózy jako energetického zdroje (nebo i na "export" jako kryoprotektantu) Ochrana před srážením krve bradykardie (při podchlazení) nebo totální zastavení oběhu (při promrznutí) vede kromě ischémie také ke zvýšení rizika srážení krve pozorujeme upregulaci serpinů (antithrombin, heparin cofactor II, complement inhibitor) jež brání koagulaci např. u želviček C. picta serpiny = kovalentní inhibitory plazmatických proteáz, jež se účastní kaskád srážení krve

102 EFŽ EFŽ Environmentální fyziologie živočichů Vladimír Košťál, 2009
Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav