Biochemie v letním semestru - MODUL A -

Prezentace na téma: "Biochemie v letním semestru - MODUL A -"— Transkript prezentace:

1 Biochemie v letním semestru - MODUL A -
Zápočet 4 praktika (A1 – A4) 3 ústní přezkoušení: Dýchání, Krev a tělní tekutiny Urogenitální systém, Acidobazická rovnováha Trávení a vstřebávání, Intermediární metabolismus

2 zápočtové přezkoušení: 18.3. / 9:00
LS Modul A / 1. ročník týden Přednáška Praktika (P) / seminář (S) 1 1) Transport kyslíku a oxidu uhličitého / F. Duška Úvod k praktickým cvičením (teorie: odběr kapilární krve, elfo, centrifugace, příprava na BCH praktika) (S) 2 2) Biochemie krevních elementů / V. Kvasnicová Elektroforéza proteinů krevního séra (S/P) A1 3 3) Biochemické aspekty funkce ledvin / F. Duška Struktura, funkce a metabolismus hemoglobinu (S) 4 KONFERENCE dýchání, krev, tělní tekutiny zápočtové přezkoušení: / 9:00 5 4) Metabolismus vody a minerálních látek / F. Duška 6 5) Acidobazická rovnováha / F. Duška ) Funkční BCH trávicího traktu / F. Duška Chem. vyšetření moči, moč. sediment (P) A2 7 ABR, interpretace vyšetření dle Astrupa (S) 8 7) Energetický metabolismus / F. Duška Vyšetření glykemie. Interpretace oGTT (P) A3 9 KONFERENCE urogen. sys./ABR zápočtové přezkoušení: 22. a 23.4 / 8:00 10 8) Obecná toxikologie / P. Tůma ) BCH jaterní buňky / J. Trnka Stanovení alkalické fosfatázy v séru (P) A4 11 10) Biotransformace xenobiotik / E. Samcová Biochemie jaterní buňky (S) 12 11) Úloha vitamínů v metabolismu / J. Trnka Biotransformace xenobiotik (S) 13 12) Volné radikály a antioxidanty / J. Trnka Vztahy v intermediárním metabolismu (S) 14 KONFERENCE trávení a vstřebávání zápočtové přezkoušení: / 9:00 15

3 Laboratorní metody - letní semestr -
Vladimíra Kvasnicová

4 Preanalytická fáze = příprava a zpracování vzorků před vlastní laboratorní analýzou náběr krve sérum x plazma každý biologický materiál je potenciálně infekční ! ukázka zpracování vzorků krve v biochemické laboratoři - video

5 Centrifugace = metoda používaná k oddělení pevných složek směsi od přítomné kapalné fáze na základě jejich velikosti, tvaru a hustoty, viskozity média a rychlosti rotoru odstředivá síla: P = m x r x 2 m – hmotnost částice r - poloměr centrifugy  - úhlová rychlost

6 Centrifugace fixní úhel rotoru nebo horizontální
centrifuga musí být vyvážená Obrázek převzat z a (únor 2008)

7 Centrifugace Obrázek převzat z (únor 2008)

8 Centrifugace rychlost: počet otáček za minutu (RPM = revolutions per minute) ! Nastavením stejné hodnoty RPM v centrifugách o různém poloměru nedosáhneme stejné odstředivé síly ! odstředivá síla: relativní odstředivé zrychlení (RCF = relative centrifugal force) RCF = 1.12 x 10-5 x r x (rpm)2 r = poloměr centrifugy (cm) jednotky: g RCF udává kolikrát je zrychlení centrifugy větší než je normální tíhové zrychlení g = 9.81 m x s-2

9 Centrifugace a) běžné laboratorní centrifugy (až 10 000 G)
b) vysokorychlostní chlazené centrifugy (až G) c) ultracentrifugy /chlazené + vakuum/ (až G) příklad: k oddělení séra ze sražené krve stačí centrifugace 10 min. při RCF = 1000 g

10 Obrázek převzat z http://www. chem. arizona
Obrázek převzat z a (únor 2008)

11 Obrázek převzat z http://science. tjc
Obrázek převzat z a (únor 2008)

12 A) Preparativní centrifugace
slouží k separaci částic od kapalné fáze získáme 2 frakce: sediment (pelleta, pevná fáze) supernatant (kapalná fáze) Obrázek převzat z (únor 2008)

13 opakováním postupu získáme frakce různých buněčných organel
frakční centrifugace (= diferenciální centrifugace) zvláštní typ preparativní centrifugace používá se k separaci buněčných organel, které se liší velikostí a hustotou při použití nízkého RCF sedimentují jen částice s velkou hustotou → vytvořený supernatant se přelije do jiné zkumavky a centrifuguje při vyšší hodnotě RCF opakováním postupu získáme frakce různých buněčných organel

14 Frakční centrifugace Obrázek převzat z (únor 2008)

15 B) Analytická centrifugace
používá se k měření fyzikálních vlastností sedimentujících částic (sedimentační koeficient, molekulová hmotnost) používají se ultracentrifugy centrifugované částice jsou během centrifugace sledovány optickým systémem (měření absorbance či zákalu) a průběh procesu je zobrazován pomocí PC

16 Elektroforéza (ELFO) = analytická metoda založená na pohybu nabitých částic vlivem vnějšího elektrického pole (stejnosměrný proud) rychlost elektromigrace závisí na: a) velikosti, tvaru a náboji částice b) vloženém napětí

17 Elektroforéza anion – negativně nabitý ion, pohybuje se směrem k anodě (+) kation – pozitivně nabitý ion, pohybuje se směrem ke katodě (-) amfolyt – látka, která může mít pozitivní, negativní či nulový celkový náboj, a to v závislosti na vnějších podmínkách (pH) např. proteiny

18 Klasifikace elektroforetických technik
volná elektroforéza separace probíhá pouze v kapalné fázi (v pufru), tj. bez účasti nosného média (kapilární elektroforéza) elektroforéza na nosičích papír, gel (agaróza, polyakrylamid) horizontální nebo vertikální uspořádání

19 Kapilární elektroforéza
Obrázek převzat z (únor 2008)

20 Kapilární elektroforéza
Obrázek převzat z (únor 2008)

21 Gelová elektroforéza - horizontální uspořádání
Obrázek převzat z (únor 2008)

22 Gelová elektroforéza – vertikální uspořádání
SDS-PAGE – animace Obrázek převzat z (únor 2008)

23 Parametry ovlivňující elektroforetickou separaci
pH mění náboj analytu (disociace) a tím i jeho pohyblivost; může měnit i strukturu analytu (denaturace) iontová síla mění napětí či proud: zvýšení iontové síly obvykle sníží migrační rychlost a způsobí zahřívání systému teplota: vysoká teplota může denaturovat (vysrážet) proteiny; nízká teplota snižuje difuzi, ale také migrační rychlost, nemá vliv na rozlišení proud: příliš vysoký proud způsobí přehřátí systému napětí: migrační rychlost je přímo úměrná napětí čas: rozlišení (vzájemné oddělení proužků) roste lineárně s časem, ale rozmytí proužků (difuze) roste se čtvercem času nosné médium: velikost pórů nosiče a endoosmóza ovlivňují migrační rychlost (výběr typu nosiče)

24 Průběh elektroforézy aplikace vzorku
nastavení vhodného napětí nebo proudu ! STEJNOSMĚRNÝ PROUD ! (gelová elektroforéza: kolem V, kapilární elektroforéza: kolem V) nastavení doby separace: řádově minuty (př. gelová elfo proteinů séra trvá asi 30 min.) při elfo na nosičích následuje po separaci fixace a barvení vyhodnocení: kvalitativní (srovnání se standardy) kvantitativní (na nosičích: densitometricky)

25 Vybavení pro gelovou elektroforézu používanou v praktiku A1
zdroj stejnosměrného proudu nádobky na barvení a odbarvování gelu elektroforetická komora aplikátor

26 Elektroforéza – příklady klinického využití -
separace proteinů séra, izoenzymů, nukleových kyselin imunoelektroforéza (imunoglobuliny) Obrázek převzat z (únor 2008)

27 Elektroforéza – příklady klinického využití -
separace proteinů séra, izoenzymů, nukleových kyselin imunoelektroforéza (imunoglobuliny) Obrázek převzat z (únor 2008)

28 Využití elektroforézy proteinů k diagnostice nemocí
rozdělení proteinů do frakcí je za fyziologických podmínek konstantní (poloha, intenzita) zastoupení proteinů v plazmě se při různých onemocněních mění (vzájemný poměr) specifický vzhled elektroferogramu (rozložení frakcí nebo píků)

29 Hlavní proteiny jednotlivých frakcí
imunoglobuliny: IgG, IgA, IgM 2-makroglobulin haptoglobin 1-antitrypsin orozomukoid transferin C3-komplement

30 Výsledek ELFO proteinů séra na agarózovém gelu – 6 frakcí
hypergama- globulinémie normální nález Obrázek převzat z (únor 2007)

31 Výsledek ELFO proteinů séra na agarózovém gelu – 5 frakcí
fyziologický nález akutní onemocnění výskyt paraproteinu frakce fibrinogenu při analýze plazmy

32 Denzitometrický záznam elektroforézy
60% 3% 9% 12% 16% Obrázky převzaty z a z (únor 2007)

33 Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M
Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M. (editor): Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 4th ed. Wiley‑Liss, Inc., New York, ISBN 0‑471‑15451‑2

34 Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M
Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M. (editor): Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 4th ed. Wiley‑Liss, Inc., New York, ISBN 0‑471‑15451‑2

35 Obrázek převzat z http://www. sebia-usa. com/products/reagents
Obrázek převzat z (únor 2007)

36 Obrázek převzat z http://www. sebia-usa. com/products/reagents
Obrázek převzat z (únor 2007)

37 IMUNOFIXACE - určování typu paraproteinu (monoklonálního Ig)
Obrázek převzat z (únor 2007)

38 Detekované paraproteiny (monoklonální protilátky /myelom )
Obrázek převzat z (duben 2007)