DNA diagnostika a principy základních metod molekulární biologie

Mol. biologická diagnostika diagnostika na úrovni DNA, RNA a proteinů analýza kvalitativní i kvantitativní proč se provádí detekce přítomnosti nukleové kyseliny specifické sekvence např. identifikace živočiš. druhu nebo jedince analýza struktury (souvislé sekvence) nukleové kyseliny stanovení genotypu např. detekce klinicky významných mutací a polymorfizmů kvantifikace nukleové kyseliny (RNA) se specifickou sekvencí hodnocení intenzity a změny exprese genů (např. tumory) kvantifikace proteinů a typů jejich post-translační modifikace nejpoužívanější techniky DNA PCR, RFLP (analýza délky restrikčních fragmentů), elektroforéza, S-hybridizace, exprese, klonování RNA reverzní transkripce, kvantifikace, N-blotting, proteiny PAGE elektroforéza, W-blotting, protilátky, imuno- precipitace, ELISA, kapalinová chromatografie (HPLC), hmotnostní spektroskopie, ..

Izolace nukl. kyselin a proteinů lýza buněk či tkání (lyzační pufry) složení pufru odpovídá záměru (lysozym, proteinázy, detergenty, chelatační činidla) odstranění ostatních kontaminujících částí s výjimkou požadovaného výsledného materiálu izolace nukl. kyselin na základě rozdílné rozpustnosti adsorpce na pevný podklad ultracentrifugace

Elektroforéza DNA nebo proteinů základní separační technika při analýze nukleových kyselin nebo proteinů principem separace je pohyb nabitých molekul (v případě DNA negativně nabitých fosfátů k anodě) v elektrickém poli v pevném nosiči (gel) a vodivém pufru gely polyakrylamidové (PAGE) = vertikálně agarózové = horizontálně elektroforézy horizontální či vertikální, popř. kapalinové rychlost pohybu v gelu je nepřímo úměrná (logaritmu) velikosti molekuly velikost konkrétní molekuly se určí pomocí velikostních standardů po separaci (při určité hodnotě mV po určitou dobu) je nutno separované molekuly zviditelnit DNA dvojvláknová – ethidium bromid (interkalace) + UV jednovláknová – SYBR green nebo barvení stříbrem proteiny přímo v gelu (Coomassie modř) po W-blottingu protilátkami na membráně modifikace pulzní elektroforéza denaturační gradientová (DDGE) SSCP heteroduplexy

Elektroforéza - postup

Elektroforéza DNA

Elektroforéza proteinů

Identifikace proteinů: W-blotting

Manipulace s nukl. kyselinami amplifikace (n-kopií) Polymerase Chain Reaction (PCR) enzymy, které specificky zasahují do jejich struktury (spec. DNA nebo RNA) polymerázy – syntetizují nukl. kyseliny fosfatázy, kinázy, metylázy – modifikují ligázy – spojují nukl. kyseliny nukleázy – odbourávají, štěpí restrikční endonukleázy = sekvenčně specifické enzymy bakterií (obrana před bakteriofágy) - >3500 enzymů rozpoznávací místo (často palindrom) názvy podle rodového a druhového jména organizmu (např. ) klonování do vektorů hybridizace různá pevnost kovalentních a vodíkových vazeb v DNA schopnost denaturace x renaturace hybridizační sondy hybridizace na membráně, in situ (FISH)

Klonování DNA jedna z nejzákladnějších metod molekulární biologie studium struktury a funkce genů (kódujících i regulačních oblastí) produkce rekombinantních proteinů (genové inženýrství) tvorba genových (cDNA) knihoven tvorba transgenních organizmů klonování = proces tvorby klonů klon = soubor identických dceřinných buněk (organizmů) vzniklých mitózou z jedné mateřské buňky molekulární (DNA) klonování = tvorba klonů DNA tvorba rekombinantních molekul DNA množením v hostitelské buňce rekombinantní DNA = vznikla spojením DNA fragmentu (inzertu) a vektoru in vitro vektor = systém, který má schpnost přijmout cizorodou DNA a replikovat se v hostitelské buňce plazmidové vektory bakteriofágové vektory umělé chromozomy (bakteriální, bakteriofágové nebo kvasinkové) viry proces klonování příprava rekombinantní DNA (vpravením inzertu do vektoru) inzert – DNA izolovaná z organizmu, cDNA, produkt PCR přenos rekombinantní DNA do hostitelské buňky (= transformace bakterií, typicky E. coli) chemicky nebo elektricky selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA součástí vektoru je gen kódjící rezistenci k určitímu antibiotiku, bakterie bez vektoru nerostou na půdě s antibiotikem pomnožení rekombinantích klonů a jejich další použití transfekce eukaryontních buěk, exprese proteinu, …

Klonování DNA - využití klonování = tvorba klonů (identických molekul DNA) rekombinantní DNA vznikne spojením inzertu (cizorodé DNA) s vektorem aplikace studium funkce izolovaných genů studium regulačních oblastí genů fyzikální a genetická analýza genomů exprese cizorodých genů a tvorba rekombinantních proteinů

Příklad – komerční klonovací vektor

Klonování - postup

ATB selekce transformovaných bakterií

Klonování DNA není klonování organizmu

Enzymy pro manipulaci s DNA všechny enzymy mají substrátovou specifitu – tedy DNA nebo RNA restrikční endonukleázy sekvenčně specifické enzymy produkované kmeny většiny bakterií (slouží jim k degradaci cizorodé DNA , např. plazmidu nebo bakteriofága) dnes známo cca 3 500 enzymů (procca 160 různých sekvencí) název podle rodového a druhového jména bakterie např. Eco (E. coli), Hae (Haemophilus aegypticus), Sau (Staphyloccocus aureus) rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů – 4 – 8bp (rozpoznávací místo je často palindrom) a tak štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bází a podle rozpoznané sekvence vznikají restrikční fragmenty ( restrikční mapa) DNA polymerázy připojování nukleotidů v 5’  3’ směru

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) charakterizace DNA pomocí jejího štěpení enzymy - restrikčními endonukleasami na fragmenty identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením za daných podmínek vzniká reprodukovatelný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce (= počtu bazí) počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická využití mutací v daném úseku DNA se může ztrácet nebo naopak vytvářet restrikční místo RFLP často následuje po amplifikaci DNA pomocí PCR k definitivnímu určení genotypu určení totožnosti (forenzní účely, paternita)

Hybridizace nukl. kyselin používá se k vyhledávání známých sekvencí v genových knihovnách a na chromozomech využívá se schopnosti DNA denaturovat (při vysoké teplotě) a zpětně renaturovat kovalentní vazby kostry jsou mnohem pevnější než vodíkové vazby mezi páry bází při přítomnosti značené sondy část komplementární sekvence DNA renaturuje s ní provádí se přímo na buňkách po blottingu na membráně na řezech tkání (in situ) sondy značeny radioaktivně (32P, 35S) značení fluorescenční např. FISH (fluorescent in situ hybridisation)

Southern hybridisation

FISH

cDNA knihovny geny má určitý živočišný druh v kompletní výbavě v jádře každé jednotlivé buňky ovšem exprese jednotlivých genů je specifická pro jednotlivé tkáně a různé situace zdraví  nemoc ovlivňení nějakou látkou  bez ovlivnění pokud se izoluje RNA z nějaké tkáně či skupiny buněk, přepíše se reverzní transkripcí do cDNA a ta se naklonuje do bakterií, vzniká tzv. icDNA knihovna, ve které se dají vyhledávat specifické geny, porovnávat kvantita jejich exprese atd.

Microarrays

PCR popsal v r. 1983 Kary Mullis, 1993 Nobelova cena princip enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (denaturace ~95°C, annealing ~60°C, extenze ~72°C) komponenty reakční směsi pro PCR voda pufr dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGT) MgCl2 termostabilní DNA polymeráza (například Taq z bakterie Thermus aquaticus) oligonukleotidové sondy (“primery”) templátová DNA teplotní režim 1) 95ºC 2‘ iniciální denaturace 2) 96ºC 30‘‘denaturace 3) 40-72ºC 20‘‘ annealing 4) 72ºC 30‘‘ elongace kroky 2 – 4 celkem 30x 5) 72ºC 5‘ závěrečná elongace 6) 4ºC 10‘ zchlazení

PCR produkt PCR reakce je možno zviditelnit UV světlem po elektroforetickém rozdělení (nejč. v horizontálním 1 - 3% agarózovém gelu) a obarvení interkalačními barvivy

Sekvenování DNA metoda ke zjištění primární sekvence úseku DNA nejčastěji se používá modifikací tzv. Sangerovy metody je založena na PCR a používá kromě základních nukleotidů ještě značené ddNTP (= terminátor reakce katalyzované DNA polymerázou) radioaltivně značené ddNTP – nutné 4 separátní reakce fluorescenčně značené ddNTP – pouze 1 reakce

Sekvenování DNA

DNA diagnostika proč se provádí detekce přítomnosti nukleové kyseliny (detekce přítomnosti specifické sekvence) např. identifikace živočiš. druhu identifikace jedince (forenzní) analýza struktury (souvislé sekvence) nukleové kyseliny stanovení genotypu např. detekce klinicky významných mutací a polymorfizmů dědičné choroby mutace v onkogenech a supresorových genech v nádorech kvantifikace nukleové kyseliny se specifickou sekvencí microarrays cytogenetika chromozomové aberace karyotyp