F1190 Úvod do biofyziky Masarykova Univerzita Podzimní semestr 2014 Vyučující: Prof. Jiří Kozelka, Biofyzikální Laboratoř, Ústav fyziky kondenzovaných látek, PřF MU, Kotlářská 2, kozelka.jiri@gmail.com, 720 379 379 Mgr. Karel Kubíček, Biofyzikální Laboratoř, Ústav fyziky kondenzovaných látek, PřF MU, karelk77@googlemail.com, 5449 49 3253

Co je biofyzika? Biophysics (also biological physics) is: … an interdisciplinary science that employs and develops theories and methods of the physical sciences for the investigation of biological systems. ... en.wikipedia.org/wiki/Biophysics ….the application of physical principles and methods to the study of the structures of living organisms and the mechanics of life processes. www.hss.energy.gov/HealthSafety/ohre/roadmap/achre/glossary.html … that branch of knowledge that applies the principles of physics and chemistry and the methods of mathematical analysis and computer modeling to understand how biological systems work. www.biophysics.org/tabid/517/Default.aspx … an interdisciplinary field which applies techniques from the physical sciences to understanding biological structure and function at the molecular level. www.britishbiophysics.org.uk/what-is/whatis.html

1. Svinování proteinů: Proteiny jsou řetězce složené z pouze 20 druhů aminokyselin. Jak je možné vytvořit z jen 20 monomerů polymery s tak rozmanitou strukturou a s tak různými funkcemi?  Studium prostorové struktury proteinů pomocí spektroskopických metod (absorpční spektrofotometrie, cirkulární dichroismus, vibrační spektroskopie, NMR, EPR [pro paramagnetické proteiny], molekulové modelování) Struktura fragmentu lidské DNA-polymerazy b vázající DNA. (pdb kód 7IGG)

2. Replikace DNA: Jakým mechanismem se při dělení buňky vytvoří z nesmírně dlouhé dvojité šroubovice DNA (u člověka: ~3 m) dvě nové identické dvojité šroubovice? Metody studia: Organická syntéza (k manipulaci DNA, modifikaci bazí, značkování nukleotidů radioaktivními prvky atd.), gelová elektroforéza, spektroskopické metody, měření kinetiky reakcí, metody k oddělení frakce DNA z buněčných extraktů (např. ultracentrifugace)

3. Svinování RNA: Jak je možné, že molekula RNA, disponující pouze čtyřmi stavebními prvky (nukleotidy s bázemi guanin, adenin, cytosin, uracil) dokáže vytvořit rozmanité 3D-struktury a plnit celou řadu funkcí v buňce (přenos informace z DNA do ribosomu, katalýza štěpných reakcí za účasti kovových kationtů v tzv. ribozymech...)? Metody studia: Organická syntéza (k manipulaci RNA, modifikaci bazí, značkování nukleotidů radioaktivními prvky atd.), gelová elektroforéza, spektroskopické metody, měření kinetiky reakcí, metody k oddělení frakce DNA z buněčných extraktů (ultracentrifugace), metody anorganické chemie ke studiu role kovových kationtů coby kofaktorů a při prostorovém sbalování RNA)

Hemoglobin Hemocyanin Hemerythrin 4. Jak se dostane kyslík do buněk, které ho mají zapotřebí? Metaloproteiny transportující kyslík: vazebná místa Hemoglobin (obratlovci, někteří bezobratlí) Hemocyanin (měkkýši, někteří členovci) Hemerythrin (někteří mořští bezobratlí) Lippard: Bioinorganic Chemistry, 1994 Metody studia: Rentgenová krystalografie, NMR, EPR a molekulové simulace ke zjištění prostorového uspořádání metaloproteinů transportujících kyslík, spektroskopické metody ke studiu vazby kovových kationtů (Fe2+, Cu+) na kyslík, dozimetrie k měření koncentrace O2 a CO2, anorganická syntéza umělých transportérů O2 napodobujících aktivní místo metaloproteinu, kde proteinová kostra je nahrazena malými organickými nebo anorganickými ligandy, kvantově-chemické výpočty k pochopení reakčních mechanizmů

Chloroplast Thylakoid 5. Fotosyntéza: jaký je molekulární mechanismus syntézy cukrů z CO2 a H2O ? Chloroplast Thylakoid

PS2: Photosystem 2 PS1: Photosystem 1 Fotosyntéza v zelených rostlinách: přeměna energie v thylakoidové membráně chloroplastů V 1. řetězci oxidačně-redukčních reakcí elektron s vysokou energií putuje od „antény“ k jiným molekulám, které si jej navzájem předávají. Přitom se energie elektronu používá na „pumpování“ protonů (H+) napříč membránou. 1. absorpce fotonu s energií hn2 „anténními barvivy“, přenos excitační energie do reakčního centra, tam vypuzení excitovaného elektronu 2. řetězec oxidačně-redukčních reakcí, další „pumpování“ protonů (H+) napříč membránou. 2. Po předávce e- do redox-řetězce se anténa stane tak silným ox. činidlem (=příjemcem e-), že je schopna oxidovat H2O na O2; přitom se uvloní 2H+ ATPasa (molekulární motor): přeměna elektrického potenciálu H+ na chemickou, syntéza ATP jako malého zásobníku energie 2. absorpce fotonu s energií hn2 jiným „anténním barvivem“ PS2: Photosystem 2 PS1: Photosystem 1

7. Jak detekují naše smysly světelné, zvukové, hmatové vjemy, a jak jsou tyto vjemy přeměňovány na elektrické impulzy? http://fyzika.jreichl.com/main.article/view/486-stavba-oka Metody studia: Komplexní anatomické experimenty, spektroskopická, akustická, elektrická a mechanická měření, studie fotochemických reakcí a j., viz násled. dia

Tyto otázky jsou diskutovány v přednášce Opsin + 11-cis-retinal = „oční pigment“ („visual pigment“) Lidská sítnice obsahuje 4 různé oční pigmenty: Rodopsin v tyčinkách, lmax= 500 nm Jodopsin v čípcích Červený, lmax= 557 nm Zelený, lmax= 530 nm Modrý, lmax= 425 nm - Jakým způsobem je absorpce fotonu přeměněna na nervový signál do mozku? - Jakým způsobem modulují rodopsin a jodopsiny vlastnosti cis-retinalu tak, že tato molekula mění vlnovou délku, při které maximálně absorbuje světlo? Tyto otázky jsou diskutovány v přednášce „Základy molekulární biofyziky“, F5351, ve 3. ročníku studia biofyziky

8. Jaká metoda je vhodná pro které lékařské vyšetření pacienta 8. Jaká metoda je vhodná pro které lékařské vyšetření pacienta? Jak interaguje který typ vlnění s živou hmotou? Jak určit optimální vlnovou délku, intenzitu, druh zdroje? RTG MRI CT EKG Ultrazvuk Magnetoterapie Scintigrafie Metody studia: Fyzikálně-chemické experimenty in vitro (na biomolekulách v chemické laboratoři, na buněčných kulturách v biologické laboratoři) a in vivo (na zvířatech), klinické studie. Stěžejní roli hraje statistické vyhodnocování experimentů, velmi často nutno použít výpočetní metody.

Biofyzika je mezioborová věda Biofyzik je konfrontován s problémy zasahujícími do Fyziky Biologie Chemie Medicíny Matematiky Jako každý přírodovědec, musí ovládat principy statistického vyhodnocování experimentů Connections among biosciences, fundamental sciences, and some of the applied sciences A. I. Popescu,

What are the career options for biophysicists? Because of the breadth of their training, biophysicists have a wide range of career options. Job opportunities exist in both the private and public sectors, especially in the realms of medical science forensic science radiation science biotechnology environmental science agricultural science computational biology. For example, there is demand for biophysicists in many large and small biomedical companies (e.g., BIOVENDOR, Brno, Czech Republic) and in public institutions such as the CEITEC or NCBR (research centers of the Masaryk University), or the Instituet of Biophysics of the Czech academy of Sciences, research units in hospitals, and public policy agencies. Biophysicists are expected to be in high demand in the environmental sector, too, because so many of the problems faced by life on Earth today have a physical root. lékařství forenzní vědy nauka o záření, radiologie biotechnologie ekologie agrární vědy výpočetní biologie Adapted from: http://www.biophysics.yorku.ca/

Výzkumné projekty Biofyzikální laboratoře MU Strukturní studie interakcí mezi protinádorovými komplexy platiny a DNA 2. Studium interakce proteinu (tubulinu) s protinádorovým léčivem 3. Studium interakce proteinu s nukleovými kyselinami pomocí NMR a AFM 4. Studium vlastností membrán pomocí AFM a Langmuirovy-Blodgettové vaničky 5. Studium fyzikální podstaty slabých interakcí zvaných lone-pair-p

Syllabus přednášek, otázky a řešení ke cvičením, otázky ke kolokviu jsou vyvěšovány na stránkách Biofyzikální Laboratoře: http://physics.muni.cz/biophys/vyuka.shtml

http://is.muni.cz/el/1451/podzim2007/bk200/Biochemie.txt

V úvodu se soustředíme na prvky H, C, O, N, P, S, které tvoří základní stavební kameny nukleových kyselin a proteinů: nukleotidy a aminokyseliny.

Izotopy šesti nejvýznamějších biogenních prvků Prvek Izotopy stabilní* (jaderný spin; %) Izotopy radioakt. (poločas rozpadu) Oxidační čísla ve sloučeninách H 1H (1/2; 99.8%) 2H (1; 0.2%) 3H (12.3 y) b -I, +I C 12C (0; 89.9%) 13C (1/2; 1.1%) 14C (5730 y) b -IV,-III,-II,-I,0,+I,+II,+III,+IV N 14N (1; 99.6%) 15N (1/2; 0.4%) -III,+I,+II,+III,+IV,+V O 16O (0; 99.96%) 17O (5/2; 0.04%) -II (O2-,H2O), -I (O22-, H2O2), -0.5 (O2-, superoxid) P 31P (1/2;100%) 32P (14.3 d) b -III, +III, +V (fosfát) S 33S (3/2; 0.76%) -II, +IV, +VI Izotopy s nenulovým spinem je možno detegovat pomocí Nukleární Magnetické Rezonance (NMR) Izotopy se spinem ½ je možno detegovat s vysokým rozlišením

Využití radioaktivních nuklidů 1. Určování stáří organických látek metodou radioaktivního uhlíku Do vnější atmosféry proniká z kosmu záření, které vede k jaderným reakcím, při nichž vzinkají volné neutrony. Ty nárazem do molekul dusíku mohou vyvolat jadernou reakci, při níž se molekula rozpadne a jeden atom pohltí neutron a ztratí proton. Dojde k jakémusi „vyražení“ protonu neutronem. Z izotopu 14N se tak stane izotop uhlíku 14C. Tyto atomy jsou oxidací zabudovány do molekul CO2. Izotop 14C však není stabilní. V jiné jaderné reakci se jeho jeden neutron přemění na proton, elektron a antineutrino. Elektron a antineutrino jsou vyzářeny do prostoru, zbyde izotop dusíku 14N. Těmito dvěma jadernými reakcemi se postupem doby ustálila v atmosférickém CO2 víceméně konstantní koncentrace izotopu 14C, přibližně 10-6 %.

Zelené rostliny používají CO2 k fotosyntéze, samy jsou potravou živočichů. Je-li atmosférický CO2 zabudován do živého organizmu, udžuje se podíl izotopu 14C na konstantní úrovni, neboť dochází ke stálé výměně uhlíkatých látek s atmosférickým CO2. Tato výměna končí smrtí organizmu a u mrtvého organizmu pak podíl 14C klesá s poločasem rozpadu 5730 ± 40 y (do vnitřní atmosféry neutronové záření neproniká). Analýzou izotopů uhlíku v mrtvém organizmu je tedy možno stanovit dobu uplynulou od jeho smrti. Počet atomů, který se rozpadne za infinitesimální časovou jednotku, je přímo úměrný stávajícímu počtu atomů N: l je rychlostní konstanta pro tuto reakci, tzv. rozpadová konstanta. Řešení této diferenciální rovnice je exponenciální funkce: Poločas rozpadu t1/2 je čas, za který se rozpadne 50% materiálu. Je to parametr nepřimo úměrný rychlostní konstantě l : 1/2 = exp(-lt1/2) -ln2 = -lt1/2 t1/2= ln2/l Poločasu rozpadu 5730 ± 40 y tedy odpovídá rychlostní konstanta l = (1.21 ± 0.01) 10-4 y-1 Cvičení 1: odvoďte rovnici pro t1/2 Cvičení 2: vypočítejte l

Cvičení 3 Analýzou kosti zvířete bylo zjištěno, že obsahuje 70% z původního množství izotopu 14C. Určete stáří zvířete, když poločas rozpadu izotopu je 5730 ± 40 y. (Požadováno je řešení, výsledek a standardní odchylka.) Využití radioaktivních nuklidů 2. Detekce fragmentů nukleových kyselin (oligonukleotidů) označených radioaktivním izotopem fosforu 32P

Příklad: Protein LEF-1 je tzv Příklad: Protein LEF-1 je tzv. transkripční regulátor, který reguluje produkci (expresi) antigenových receptorů na povrchu lymfocytů T. Jeho funkcí je vázat DNA na specifické sekvenci 5'-CCTTTGAA a vytvořit v DNA ohyb, který je předpokladem k transkripci. Je zajímavé zjistit, s jak velkou afinitou se váže doména HMG (zelená stuha) proteinu LEF-1 na DNA, která obsahuje sekvenci 5'-CCTTTGAA (modrá/zlatá). Při vzniku komplexu mezi DNA a LEF-1 hraje důležitou úlohu aminokyselina methionin (hnědá), která se vklíní („interkaluje“) mezi dvě adeninové báze (tlusté modré čáry).

Zjištění afinitní konstanty: V první fázi připojíme na jeden řetězec DNA fosfátovou skupinu obsahující radioaktivní izotop 32P pomocí radioaktivního adenosin-trifosfátu: ATP* Adenosin- P P*

Značenou DNA necháme reagovat s proteinem, přičemž se vytvoří rovnováha: Zjištění afinitní konstanty: V první fázi připojíme na jeden řetězec DNA fosfátovou skupinu obsahující radioaktivní izotop 32P pomocí radioaktivního adenosin-trifosfátu: ADP ATP* P* Adenosin- P P* +

O koncentracích v rovnováze platí: Značenou DNA necháme reagovat s proteinem, přičemž se vytvoří rovnováha: Ka: asociační konstanta Kd: disociační konstanta P* P (protein) D* (DNA) PD * (komplex) +

Reakční směs analyzujeme pomocí gelové elektroforézy: Negativně nabitá DNA migruje k anodě, směrem dolů. Volná DNA migruje rychleji než vázaná v komplexu. Jednak kvůli větší hmotnosti (a = F/m), jednak větší komplex hůře prochází póry gelu. Navíc má komplex většinou menší negativní náboj, neboť proteiny vázající se na DNA mají většinou náboj pozitivní. Po určité době gel vyjmeme z pufru, vysušíme a v temné komoře na něj přiložíme fotografický papír. Ten na místech s radioaktivním vzorkem zčerná. Intenzitu skvrny je možno kvantifikovat a použít k určení množství radioaktivní látky.

[PD]/[D]0 PD D log[P] 0 Analýza gelovou elektroforézou titrace 10 pM roztoku D vzrůstajícími koncentracemi P. Nejpřesněji lze určit poměr [PD]/[D]0 ([D]0 = celková koncentrace DNA).

[PD]/[D]0 PD D log[P] 0 Analýza gelovou elektroforézou titrace 10 pM roztoku D vzrůstajícími koncentracemi P. Nejpřesněji lze určit poměr [PD]/[D]0 ([D]0 = celková koncentrace DNA). Kd Cvičení 4: Dokažte, že pokud platí [P]0 >> [D]0, je Kd rovna koncentraci [P]0, při které je [PD]/[D]0 = 0.5