Microarray Martin Erdös

Microarray Obecný pojem zahrnující více metod Technologie umožňující provádět paralelně mnoho molekulárně - biologických analýz. Společný rys – využití čipu s navázanými „sondami“ různého charakteru (proteiny, DNA atd.), výjimka tkáňový microarray Array = sada, soubor, pole, též seřazení, uspořádání Typy: - DNA microarray Tkáňový microarray Proteinový microarray – např.protilátkový Buněčný microarray

Historie 1975 – Southern Blot (Dr. Edward Southern) - elektroforéza fragmentů DNA, následně přenos na nylonovou membránu, hybridizace s radioaktivně nebo fl. Barvivem značenými sondami. Varianty: Northern Blot (analýza RNA), Western Blot (analýza proteinů) 1987 – využití při analýze exprese genů u nádorových buněk při léčbě interferonem a bez léčby. 1995 – miniaturizovaná forma array technologie – MICROARRAY 1997 – sestavení celého genomu S.Cerevisiae a jeho umístění na čip.

Southern Blot – obrázek 

Komparativní genomická hybridizace metoda detekující změny (ve smyslu delece nebo amplifikace) v DNA u nádorových buněk Metoda neodhalí strukturální změny, při kterých se nemění množství DNA (translokace, inverze) Vzorky DNA jsou označené (fl.barvivo) hybridizace na metafazické chromosomy -fluorescent in situ hybridization (FISH) Z CGH vzniká CMA/array CGH (chromosomal microarray analysis)

DNA Microarray (DNA čip) Využívá hybridizace vzorků neznámé DNA na DNA sondy na čipu (rozdíl oproti CGH) Umožňuje komplexní analýzu exprese genů DNA Čip = Skleněná nebo silikonová destička nesoucí na svém povrchu až tisíce vzorků DNA Sondy = Specifické sekvence jednovláknité DNA odpovídající jednotlivým genům nebo jejich částem kovalentně navázané na destičce Features = vlastnosti, jednotlivé okrsky na čipu obsahující sondy jednoho typu Destička je zabudována do plastové kazety, což usnadňuje manipulaci. využití v genetice, farmakologii, imunologii, mikrobiologii,… Komerční výroba – Affymetrix, Eppendorf,…

Průběh 1. – vytvoření čipu 1)Výběr “sond“ – sondy získáme např. z cDNA knihovny 2)Uchycení sond na příslušná místa na destičce (vznik features – vlastností) – buď pouze přenesení na povrch čipu nebo syntéza in situ

Průběh 2. Vytvoření vzorku Vzorek – často mRNA 1)izolace mRNA 2)purifikace vzorku – např. elektroforeticky 3)reverzní transkripce do cDNA (komplementání vlákno DNA) 4)amplifikace – pomocí PCR 5)označení vláken cDNA – fluorescenční barvivo, radioaktivní látka 6)VÝSLEDEK = namnožená značená cDNA

Průběh 3. – Hybridizace vzorku se sondami 1)Hybridizace – navázání komplementárních sekvencí vzorku cDNA a sond na čipu - Čím podobnější sekvence, tím větší počet vodíkových můstků a silnější vazba 2)Opláchnutí čipu a odplavení nenavázaných sekvencí VÝSLEDEK = čip obsahuje sondy s navázanými sekvencemi cDNA vzorku

Získávání a zpracování výsledků 1)Čip je vložen do speciální čtečky, která pomocí laseru excituje molekuly fl. barviva. 2)Vyzařovaná energie je zaznamenána, analyzována a výsledná informace o intenzitě a lokalizaci je uchována v počítači. VÝSLEDEK = zjistili jsme, které geny byly exprimovány u dané buněčné populace. Podle intenzity světla (barvy) máme představu o množství exprimovaného genu. Přesné určení množství je ovšem obtížné

Microarrayer

Dvoukanálový experiment Porovnáváme 2 vzorky. př.1 - dvě populace kvasinek – jedna rostoucí za aerobních, druhá za anaerobních podmínek – rozdílná exprese některých genů Př.2 – buňky napadené virem, zdravé buňky Značení dvěma barvivy – např. červeným a zeleným

Příklady - Genetická úprava potravin Projekt úpravy citrusových plodů Kalifornská univerzita Riverside ve spolupráci s firmou Affymetrix - Vývoj GeneChip Citrus Genome Array Stanovení genomu a asociace genů z různými vlastnostmi – chuť, kyselost, atd.

Tkáňový microarray Zásadně odlišná metoda od DNA microarray. – jednotlivé okrsky na čipu obsahují vzorek tkáně. Urychlení analýzy tkání – možnost analýzy až 1000 vzorků v jednom mikroskopickém preparátu Odběr vzorků (např. nádorové tkáně) dutou jehlou ve formě válečků o průměru 0,6 mm z primárních parafinových bločků (z biopsií,…) a jejich přenos do recipientního bločku. Výhody – tkáň je po odebrání vzorků pro TMA použitelná na další vyšetření, nedochází k jejímu znehodnocení Využití zejména ve výzkumu rakoviny Z jednoho TMA bloku je možné připravit až stovky řezů.

TMA – příprava 4 fáze 1)Vybrání vhodných vzorků a vytvoření plánu TMA =========== 2)Příprava recipientního bločku – probíhá za pokojové teploty, proto je nutné použít speciální parafín 3)Příprava TMA - tvorba dírek, do kterých se vloží vzorky tkání. Nutné vložit všechny vzorky stejně hluboko. 4)Rozřezání bločku a vytvoření preparátů.

Protein microarray (proteinový čip) Také biochip, proteinchip Slouží k analýze proteinů a jejich interakcí s jinými molekulami Jako sondy jsou využívány proteiny, protilátky, enzymy, receptorové molekuly,… Detekce pomocí fluorescenčních barviv

Typy proteinového microarray Microspot ELISA Detekce antigenu Protilátka Imobilizovaná na podkladu Detekce pomocí značené protilátky Podobné klasické ELISA, ale v mikroskopických rozměrech Protiláktový microarray – značení antigenu přímo, bez použití protilátky. Imunologie – stanovování autoprotilátek

Shrnutí a Závěr Výhody: možnost provádět velké množství analýz najednou. Metoda je levná a rychlá Nevýhody: velký objem dat, někdy sporná výpovědní hodnota. Etické dilema Budoucnost: Potenciálně metoda rychlé a přesné diagnostiky chorob a odpovídající individuální léčba

Odkazy http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM - DNA microarray - princip http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM&feature=related - aplikace u buněk napadených virem http://digiweb.ihned.cz/c1-23156255-geneticky-cip-alias-genechip - genetická úprava potravin http://www.youtube.com/watch?v=AsC3WzyNa_Y -tkáňový microarray

Zdroje http://digiweb.ihned.cz/c1-23156255-geneticky-cip-alias-genechip Klin. Biochem. Metab., 14 (35), 2006, No. 2, p. 89–95. Tissue Microarrays - Ronald Simon, Martina Mirlacher, and Guido Sauter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.pathologyoutlines.com http://www.whatman.com/ProteinMicroarrays.aspx Wikipedia (obrázková příloha)

Konec 