SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH METOD UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Katedra ekologie a životního prostředí Jana CUPALOVÁ

BAKTERIÁLNÍ SPOLEČENSTVO SEDIMENTŮ HYPOREÁLU A JEHO ANALÝZA hlavní formou výskytu bakterií v hyporeálu je biofilm, tj. komplex organických látek, mikroorganismů a jejich extracelulárních produktů, pevně vázaný na podklad (substrát) využití běžných molekulárních detekčních metod není možné bez předchozí úpravy sedimentu (sonifikace, detergenty, hustotní centrifugace)

Problémy spojené s izolací a detekcí baktérií I. 1.Volba zrnitostní frakce sedimentu pro analýzu 2.ukotvení bakterie k substrátu i v matrix je velmi pevné a často je možné přerušit je fyzikálními nebo chemickými prostředky pouze u určitého procenta organismů, část tak zůstává nedetekovatelná. 3.Velikost a aktivita baktérií - bakterie sedimentu jsou často velmi malé a pomalu rostoucí a tím pádem hůře detekovatelné než bakterie volné vody

Grain size < 1mm represents ~ 20 % of total sediment weight, however, 60 % of total POC of the sediment 60 % TPOC < 1 mm Grain size < 1mm 20 % < 1 mm Dry sediment

Grain size fraction < 1 mm 1 : 9 < mm < 1 mm Parameter fine fraction (n) coarse fraction (n) TPOC (mg. g -1 DW) 27.1 ± 1.3 (52) 4.0  0.2 (52) Carbohydrates (mgC. g -1 DW) 26.2  4.2 (16) 0.4  0.1 (16) Bacteria (10 10 cells.g -1 DW) 21.9  38.3 (36) 0.4 ± 0.5 (16) Proteins (  g.g -1 DW)  8.3 (32) 95.4  2.7 (31) FDA (  mol.g -1 DW.h -1 ) 19.3  23.3 (16) 2.9  1.8 (16) Fine fractionCoarse fraction

Celková bakteriální abundance snímek DAPI z epifluorescenčního mikroskopu sediment volná voda, kultivace s přídavkem DOC

4. Nízký obsah cílových nukleových kyselin je příčinou slabého nebo dokonce nezachytitelného signálu (excitačního paprsku) a tím často podhodnocení celkové bakteriální abundance (FISH)(Amann et al., 1995). 5. K tomuto problému se v případě detekce in situ často přidružuje ještě tzv. maskování („masking effect“) buněk nečistotami, resp. sedimentem (Kepner et al, 1993). Problémy spojené s izolací a detekcí baktérií II.

MOLEKULÁRNÍ DETEKČNÍ METODY - taxonomické složení bakteriálního společenstva sedimentvolná voda, kultivace s přídavkem DOC snímek FISH z epifluorescenčního mikroskopu

Postup při analýze vzorku Odběr vzorků Extrakce buněk ze sedimentu Mikroskopická analýza Barvení DAPI a FISH Freeze-core (N 2 ) sonikace

DETERGENT, SONIKACE A HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE PŮSOBENÍ DETRERGENTU A ULTRAZVUKOVÝCH VLN přerušení vazeb bakterie- částice, resp. bakterie- bakterie PO CENTRIFUGACIPŘED CENTRIFUGACÍ rozdělení částic vzorku podle jejich hustoty 5-(N-2,3-dihydroxypropylacetamido) – 2,4,6 – trijodo –N, N´- bis(2,3- dihydroxypropyl) isophtalamide

ZHODNOCENÍ EFEKTIVITY HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE frakce rozměr [mm] a< 1 b1- 3 c3- 5,6 d5,6- 22,4 signifikantní rozdíl vzorků před a po centrifugaci (ANOVA, repeated measures; p< 0,05)

-kombinace využití sonifikace, detergentu a hustotní centrifugace byla posouzena jako vhodná a efektivní pro separaci bakterií a sedimentu - zařazení těchto „přípravných“ metod před vlastní molekulárně- detekční postupy významně zvýšilo počet detekovatelných bakteriálních buněk SHRNUTÍ

cílový roztok detergentu požadované množství 400 ml složkakoncentrace složky, molární hmotnost množství difosforečnan sodný M = 446 g.mol -1 0,1 M výsl. koncentracem = 17,84 g Tween 200,5% výsledná koncentraceV = 2 ml NaCl9,0 g. l -1 m = 3,6 g destilovaná vodadoplníme do výsledného objemu

Ultrazvukové vlny o vysoké energii rozrušují agregáty sedimentů, destruují vlákna fibril i kotvící vrstvy exopolymerů, kterými jsou bakterie přichyceny k povrchu, nebo dokonce odtrhávají celé kusy biofilmu. Kromě toho však při určité vlnové délce a intenzitě porušují také struktury vlastních buněk, zapříčiňují jejich praskání a tím možné zkreslení následných detekčních metod isopyknická centrifugace v hustotním gradientu probíhá výhradně na principu různé hustoty částic, tedy nezávisle na jejich ostatních vlastnostech (velikosti, tvaru, viskozitě aj). Základem je prostředí o měnící se hustotě (hustotní gradient), přičemž rozsah hustot média leží v oblasti očekávaných hustot dělených částic. Hustoty obvykle přibývá od horního okraje centrifugační zkumavky ke dnu. Chemické postupy, jejichž cílem je oddělit bakterie od substrátu, pracují především s nejrůznějšími detergenty, tedy obecně látkami, které mají schopnost snižovat povrchové napětí vody a tím výrazně zesilovat její vlastnosti rozpouštědla. Účinnost takových látek však závisí na charakteru vazby bakterie- substrát; jsou-li cílové buňky součástí biofilmu, efektivita použití detergentu může být velmi nízká.

HYPOREÁL ZÁSADNÍ VÝZNAM PRO: hydrogeologický režim krajiny ekologii toku (biomineralizace, samočištění) HYPOREÁL = veškeré propustné prostředí dna a břehů vodního toku, v němž dochází k mísení vody z toku s vodou podzemní (White, 1993)

Sediment analysis Granulometry Biofilm organic carbon (BPOC) Bacterial abundance and biomass Respiration Carbohydrates and proteins Bacterial production Enzyme activity Gas production potential Plant detritus organic carbon Freeze-core with liquid nitrogen Two layers (0-20 cm and cm) were separated