Analýza mutace C282Y v genu pro hemochromatózu

PCR – mutace C282Y (hemochromatóza) MASTER MIX – na 1 vzorek 15,8 ul H2O 2,5 ul pufr 1,5 ul primer 1 (P1) 1,5 ul primer 2 (P2) 2,0 ul MgCl2 0,5 ul dNTP 1,0 ul DNA 0,2 ul Taq polymeráza (přidat na ledu)

PCR – mutace C282Y - ELFO

RFLP –polymorfizmus délky restrikčních fragmentů restrikční analýza DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleázami (RE) ve specifických restrikčních místech pokud sekvenční diference (polymorfizmus) vytváří nebo ruší specifické místo pro RE, vznikají po restrikci fragmenty odlišných velikostí

RFLP –polymorfizmus délky restrikčních fragmentů restrikční analýza DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleázami (RE) ve specifických restrikčních místech pokud sekvenční diference (polymorfizmus) vytváří nebo ruší specifické místo pro RE, vznikají po restrikci fragmenty odlišných velikostí

RFLP –polymorfizmus délky restrikčních fragmentů Restrikční endonukleázy (RE) známo asi 2100 bakteriálních RE RE rozpoznávají různě krátké sekvence nukleotidů (4,6,8),ve kterých pak štěpí kovalentní fosfodiesterové vazby Princip analýzy výchozí DNA (genomická DNA, PCR produkt) štěpení restrikčním enzymem na fragmenty různých velikostí elektroforetická separace fragmentů

Sekvence oblasti mutace C282Y 5´- TGGCAAGGGTAAACAGATCCctctcctcatccttcctctttcctgtcaagtgccctcctttggtgaaggtgacacatcatgtgacctcttca gtgaccacactacggtgtcgggccttgaactactacccccagaacatcaccatgaagtggctgaaggataagcagccaatggatgccaaggagttcgaac ctaaagacgtattgcccaatggggatgggacctaccagggctggataaccttggctGTACcccctggggaagagcagagatatacGTGCcaggtgg agcacccaggcctggatcagcccctcattgtgatctggggtatgtgactgatgagagccaggagctgagaaaatctattgggGGTTGAGAGGAGTGC CTGAGgaggtaattatggcagtgagatgaggatctgctctttgttagggggtgggctgagggtggcaatcaaaggctttaacttgctttttctgttttagagccctca ccgtctggcaccctagtcattggagtcatcagtgga – 3´ Primery místo GTAC štěpí restrikční endonukleáza RsaI místo mutace C282Y změna GTGC na GTAC

RFLP – mutace C282Y MASTER MIX – na 1 vzorek 7,0 ul H2O 2,0 ul pufr 10 ul PCR produkt 1,0 restrikční endonukleáza RsaI (přidat na ledu) Inkubovat 37°C 2 hod

RFLP – mutace C282Y - ELFO

HEMOCHROMATÓZA hereditární hemochromatóza - relativně časté dědičné onemocnění charakterizované vstřebáváním nadbytku železa, jeho ukládáním v orgánech a z toho pak rezultujícím poškozením organismu hepatopatie, diabetes mellitus, arthropatie, impotence, amenorhea, kardiomyopatie, endokrinní poruchy sérové železo, saturace transferinu, sérový ferritin, jaterní biopsie venepunkční terapie, desferrioxamin

Mutace HFE genu