DIAGNOSTIKA PORUCH HEMOKOAGULAČNÍ ROVNOVÁHY Jan Živný Department of Pathophysiology jzivny@LF1.cuni.cz

HEMOKOAGULAČNÍ ROVNOVÁHA KREVNÍ DESTIČKY PLAZMATICKÝ KOAGULAČNÍ SYSTÉM KOAGULAČNÍ, FIBRINOLYTICKÝ, KALIKREIN-KININOVÝ CÉVNÍ STĚNA ENDOTEL Toto je na úvod - základní systémy jejichž kooperací je udržována hemokoagulační rovnováha. HEMOSTÁZA JE INTEGRÁLNÍ SOUČÁSTÍ ZÁNĚTOVÉ ODPOVĚDI

PORUCHY HEMOKOAGULAČNÍ ROVNOVÁHY - TROMBÓZA A EMBOLIE V MIKROCIRKULACI ŽILNÍ ARTERIÁLNÍ K symptomatologii poruch hemokoagulační rovnováhy je nutné zdůraznit, že řada poruch má trombo-hemoragické projevy i v jedné fázi onemocnění. Je to především DIC, ale o DIC bude seminář na podzim, a proto ji probírat nebudu. Patří sem ale přítomnost antifosfolipidových protilátek například při SLE. Antifosfolipidové protilátky se projevují jako lupus antikoagulans a na druhé straně inhibují protein C systém a působí tak protromboticky. OBECNÉ PŘÍZNAKY - ISCHEMIE TKÁNÍ - OBĚHOVÉ SELHÁNÍ PLICNÍ SYSTÉMOVÁ EMBOLIE

Pathogenesis of Thrombosis Virchow's Triad Abnormality /Injury of the vessel (endothelium) Alterations in blood flow Abnormality of the blood (hypercoagulability)

Abnormal Blood Vessel Trauma Vasculitis Atherosclerosis Others

Abnormal Blood Flow Decreased mobility Vessel Obstruction Eccomomy class syndrome Pregnancy

Abnormal Blood Abnormal Blood - hypercoagulable states a. Acquired (1) Stress (a) Postoperative State (b) Pregnancy (c) Oral contraceptives (2) Lupus-Type Anticoagulant and the antiphospholipid syndrome - Autoantibodies that recognize phospholipid and protein prolong coagulation tests like the aPTT, but, paradoxically, through a variety of mechanisms, may lead to thrombosis. (3) Reduced natural anticoagulants (a) DIC - Leads to the consumption of both procoagulants and anticoagulants. (b) Malignancy (c) Nephrotic syndrome - Antithrombin and some contact factors are lost inthe urine in the nephrotic syndrome. (4) Abnormal Platelet Function (a) Myeloproliferative disorders - Malignant disorders of the bone marrow that lead to the production of abnormal platelets which may hyperfunction (leading the thrombosis) or hypofunction (leading to hemorrhage). (b) HIT (Heparin Induced Thrombocytopenia with thrombosis) (5) Abnormal Fibrinolysis - Plasminogen Deficiency, Contact Factor Deficiency

Abnormal Blood Inherited Deficiency or Abnormal Function of  Natural Anticoagulants   Abnormal FactorPrevalence*Factor VLeiden - APCR15-30%Prothrombin Gene Mutation7-10%Protein C5-6% Protein S5-6%Antithrombin III<1% *Prevalence is for first thrombosis #Remember that Factor VLeiden is a common mutation in northern Europeans, but has lower incidence in southern Europe and is essentially absent in the Asian and African-African populations.

Arterial Thrombi formed in higher flow made up of primarily platelets and fibrin - white thrombus generally occlusive Arterial Thrombi: These thrombi are formed in higher flow,are made up of primarily platelets and fibrin (white thrombus), with layers enriched for fibrin and red blood cells called the lines of Zahn and are generally occlusive, leading to infarcition.

Fate of the Thrombus Resolution - complete healing Embolization Organization - with recanalization or incorporation into the vessel wall Fate of the Thrombus: a. Resolution - complete healing b. Embolization - release from the site of formation and travel in the vessel to the next constriction. c. Organization - with recanalization or incorporation into the vessel wall

ŽILNÍ TROMBOEMBOLICKÁ NEMOC INZULT min.- hod. DVT distální (infra)popliteální oblast DVT proximální iliofemorální oblast Příklad tromboembolické nemoci je uveden v klinické symptomatologii proto, že je epidemiologicky velmi závažná, a také proto, aby se zdůraznila možnost klinicky latentní fáze od inzultu k symptomu. roky hod. - dny Posttrombotický syndrom Plicní embolie

Prevalence of Congenital Thrombophilia Factor General Population APCR: factor V Leiden mutation 3-8% of Caucasians    Prothrombin G20210A 2-3% of Caucasians Antithrombin deficiency 1 in 2-5000   Protein C deficiency 1 in 300 Protein S deficiency Unknown Hyperhomocysteinemia 11%

KLINICKÉ PŘÍZNAKY DVT/PE Časná hluboká žilní trombóza (DVT) asymptomatická : způsobuje > 50% PE. B) symptomatická: otok pasivní bolest nebo palpační bolestivost, změny zbarvení a teploty kůže, Homansův příznak

KLINICKÉ PŘÍZNAKY DVT/PE Posttrombotický syndrom Příznaky chronické DVT - s latencí 3 - 15 let po inzultu Následkem rozvoje DVT Náplň povrchových kolaterálních žil Lipodermatoskleróza, varixy, Ulcerace kůže DK - 50% v důsledku DVT.

KLINICKÉ PŘÍZNAKY DVT/PE Plicní embolie (PE) Dle závažnosti: dyspnoe, tachypnoe, tachykardie pleuritická bolest na hrudi zvýšená náplň krčních žil hemoptýza oběhová nestabilita oběhové selhání až náhlá smrt

Klinická diagnostika DVT Ultrazvuk s barevným Dopplerovým měřením Impedanční pletysmografie Magnetická rezonance (MRI) Kontrastní venografie Vychytávání I125Fibrinogenu ? Metody označené otazníkem jsou málo specifické i senzitivní pro danou diagnostiku. Metoda vychytávání I125 FBG je vysoce falešně pozitivní pro diagnostiku DVT.

Klinická diagnostika PE Ventilačně perfúzní plicní scan Plicní angiografie CT Pravostranná srdeční katetrizace Echokardiografie Arteriální krevní plyny ? EKG ? RTG hrudníku ?

Laboratorní vyšetření hyperkoagulačních stavů Anti-fosfolipidové prtilátky: Immunoassay (ELISA, RIA) APCR (Activated Protein C Resistence) Factor V Leiden a Prothrombin 20210 pomocí „Polymerase Chain Reaction“ (PCR) Měření specifických antikoagulačních proteinů Vyšetření fibrinolytického systému - aktivátorů plazminogenu tPA , uPA a jeho inhibitoru PAI-1, stanovení plazminogenu, jeho inhibitoru alfa2AP, stanovení lipoproteinu Lp (a) Persistence over time (repeat testing in >6 weeks)

Laboratorní vyšetření hyperkoagulačních stavů FDP - imunologické stanovení celkových degradačních produktů fibri(noge)nu (normál: < 1000 ug/L), ELISA nebo aglutinační semikvant. metody. Diagnostika hemokoagulačního rozvratu. Vysoké FDP při hyperfibrino(geno)lýze. D-dimer - imunologické stanovení FDP specifických pro stabilizovaný fibrin (normál < 500 ug/L). Zvýšení D-dimeru je vysoce senzitivní pro diagnostiku DVT/PE AT - funkční test stanovení aktivity antitrombinu v plazmě (normál 80 - 100% aktivity kontrolní plazmy) Při dysregulaci trombinu se AT spotřebovává v inhibičním komplexu TAT, kofaktorem je heparin. Primární nebo sekundární deficience AT (< 75%) představuje riziko trombofilie až rozvoje DIC.

PORUCHY HEMOKOAGULAČNÍ ROVNOVÁHY - KRVÁCENÍ Z MALÝCH TRAUMAT - sc., im.vpichy - eroze na sliznicích DIFUZNÍ MIKROVASKULÁRNÍ - purpury - petechie, ekchymozy (>3 mm) - orgánové apoplexie CHIRURGICKÉ Rozlišení typu krvácení je pro klinickou diferenciální diagnostiku velmi zásadní. A) trombocytopenie B) desintegrace mikrovaskulární intimy nadhraniční trauma i při funkční hemostáze selhání posttraumatické hemostázy - dysfunkce D, PKS, E

PORUCHY PRIMÁRNÍ HEMOSTÁZY KOMPLEXNÍ OBRANNÁ REAKCE ZAHRNUJÍCÍ KREVNÍ DESTIČKY A CÉVNÍ STĚNU VAZOKONSTRIKCE + AGGREGACE Prodloužení krvácivosti (Duke) Typické příznaky: petechie, ekchymozy, epistaxe, podlitiny, krvácení z dásní, silné menstruační krvácení, silné krvácení z povrchových oděrek Častější u žen, zřídka pozitivní anamneza

KREVNÍ DESTIČKY Trombocytopenie x Trombocytopatie Počet destiček (PLT) 150 tis. – 400 tis. /mL pro chirurgický zákrok optimální > 100 tis. /mL těžká trombocytopenie / spontánní krvácení < 20 tis. /mL Mean platelet volume (MPV) 6 - 8 fL Platelet blood components may be stored for 5 days at room temperature Trombocytopenie x Trombocytopatie

Stanovení času krvácení (Duke 1910; Ivy 1941) Čas potřebný ke spontálnímu zastavení krvácení ze standardního poranění Funkční test primární hemostázy Duke : Měří se čas potřebný pro spontánní zastavení krvácení ze standardního vpichu do ušního lalůčku (2 - 5 min) Ivy: Měří se čas potřebný pro spontánní zastavení krvácení ze standardního řezu na předloktí Pro stanovení času krvácení se používají jednorázové lancety s pružinou, které po přiložení na předloktí a odjištění provedou automaticky standardní řez (Simplate systém). Standardnost provedení se zvyšuje umístěním tonometrické manžety nafouknuté na 40mmHg nad místo řezu.

Stanovení času krvácení (Ivy 1941) Prodloužený čas: poruchu funkce destiček těžkou trombocytopenii (< 100 000/uL) vonWillebrandovu chorobu (kvant. nebo kval. změny vWf) aspirin (>5 days) TEMPLATE BLEEDING TIME Normal Value: 2-7 minutes Principle: A bleeding time, which depends on hemostasis in a Clinical Significance: The bleeding time is a test for abnormalities in the platelet and vascular phases of coagulation. The relationship of bleeding time to platelet count can be of help in determining platalet function (see diagram). Manžeta tonometru nafouknutá na 40 mm Hg Řez 6x1 mm Normální hodnota 4 - 8 min.

Bleeding time is inversely related to circulating platelet count < ~100,000 / mL The bleeding time is inversely related to circulating platelet count in patients with thrombocytopenia owing to decreased production (closed circles, which also include 8 normal subjects) when the count is between 100,000 per ml and 10,000 per ml. Platelet function defects are represented by subjects taking aspirin (open circles) and patients with uremia (closed triangles) and inherited severe von Willebrand disease (open triangles). Many patients with idiopathic thrombocytopenic purpura have platelets with increased hemostatic competence (open squares). Harker LA. Slichter SJ. NEJM. 287(4):155-9, 1972. Harker LA. Slichter SJ. NEJM. 287(4):155-9, 1972.

Specializovaná vyšetření funkce destiček a von Willebrandova factoru Agregometrie Klasifikace kongenitálních trombocytopatií Agregace je indukovaná v PRP nebo v PB odebrané do citrátu sodného (ACD) přidáním aktivátoru (ADP, trombin, collagen) Ristocetinem indukovaná agregace destiček: funkční test: u vWD se agregace snižuje EDTA - induced PLT clumping - result in low PLT count - is an artifact which should be excluded by the peripheral blood smear evaluation and repetition of PLT count using a blood sample collected to sodium citrate RISTOCETIN IS ANTIBIOTICS WHICH INTERACTS WITH THE GP Ib ON THE PLT SURFACE AND WITH vWF IN PLASMA TO INDUCE CONFORMATION CHANGES WHICH ALLOW vWF TO BIND ON GP Ib WHICH LEADS TO AGGREGATION (MOST vWD EXCEPT TYPE 2B). some hereditary thrombocytopaties have large PLT PLT LABORATORY

Specializovaná vyšetření funkce destiček a von Willebrandova factoru Průtoková cytometrie měření destičkových receptorů a aktivace destiček Protilátky proti destičkám diagnoza autoimunitních trombocytopenií RISTOCETIN IS ANTIBIOTICS WHICH INTERACTS WITH THE GP Ib ON THE PLT SURFACE AND WITH vWF IN PLASMA TO INDUCE CONFORMATION CHANGES WHICH ALLOW vWF TO BIND ON GP Ib WHICH LEADS TO AGGREGATION (MOST vWD EXCEPT TYPE 2B).

Stanovení rezistence kapilár (Rumpel, Leede) Zjisťuje se počet petechií, které se vytvoří na určité ploše předloktí (4x4 cm) po stlačení známou silou (manžeta 10,5 kPa/10 min) nebo po aplikaci podtlaku (Brown, 1949). V klasickém uspořádání počet petechií > 5 signalizuje zvýšení fragility kapilár. Diagnotika hereditárních purpur (Weber-Rendu-Osler).

PROTEOLYTICKÉ ŠTĚPENÍ KOAGULAČNÍCH FAKTORŮ = KOAGULACE PORUCHY SEKUNDÁRNÍ HEMOSTÁZY PROTEOLYTICKÉ ŠTĚPENÍ KOAGULAČNÍCH FAKTORŮ = KOAGULACE Prodloužené koagulační časy (aPPT, PT, TT) typické příznaky: vnitřní hematomy, hemartroza, zpožděné krvácení častější u mužů častá pozitivní rodinná anamneza

Vyšetření PKS Krev odebraná do citrátu sodného se odstředí Získá se tak citrátová plazma chudá na destičky (PPP), která se použije k testu.

Protrombinový čas PT (Quickův test) test simuluje hlavní cestu aktivace PKS cestu tkáňového faktoru (extrinsic pathway) Do citrátové plazmy se přidá přebytek tkáňového tromboplastinu (tkáňový faktor v negativně nabitých fosfolipidech) a CaCl2. V koagulometru se měří čas vzniku fibrinového vlákna. Normální hodnoty: PTN= 12 - 15 s Prodloužení PT: deficit FV nebo vit. K dep. FII, VII, X těžký deficit FBG, vysoké FDP, porucha konverze FBG, v určitém uspořádání není ovlivněn heparinem (do 1 U/mL)

Protrombinový čas PT (Quickův test) test simuluje hlavní cestu aktivace PKS Využití testu: screeningový test řízení orální antikoagulační terapie antagonisty vit. K test jaterní proteosyntézy (FVII) Vyjadřování výsledků: Mezinárodní normalizovaný poměr (INR) INR= (PTPacient/ PTNormal)ISI ISI = mezinárodní index senzitivity užitého tromboplastinu (většinou > 1). INR je oficiálně určen pouze pro řízení orální antikoagulační terapie (max. terapeut. INR = 4,5), používá se však často všeobecně RAISED TO ISI POWER

Aktivovaný parciální tromboplastinový čas APTT test simuluje kontaktní cestu aktivace PKS (vnitřní cestu) Do citrátové plazmy se aplikuje kontaktní aktivátor (např.kaolin) pro aktivaci kontaktního systému a negativně nabité fosfolipidy pro umožnění tvorby FX- a FII- aktivačních komplexů. Plazma se rekalcifikuje CaCl2 a v koagulometru se měří čas do vzniku fibrinového vlákna. Normální hodnoty: APTTN = 27 - 35 s Využití testu: screeningový test, diagnostika deficitu faktorů “vnitřního“ systému, lupus antikoagulans, řízení heparinové terapie.

Aktivovaný parciální tromboplastinový čas APTT test simuluje kontaktní cestu aktivace PKS (vnitřní cestu) Prodloužení APTT: deficit FII,V, X, deficit kontaktních faktorů - F XII, PK, HMWK, deficit FXI, FIX , FVIII (hemofilie C, B,A) lupus antikoagulans těžkýdeficit FBG vysoké FDP porucha konverze FBG Zkrácení APTT: protrombotický stav Vyjadřování výsledků: APTT pacienta, APTT kontroly (normálu), Při heparinové terapii řízené APTT požadováno 1,5x - 2,5 x prodloužení.

Ostatní vyšetření PKS FBG - stanovení concentrace fibrinogenu v plazmě (normál : 2 - 4 g/L). Funkční (klotabilní FBG) nebo imunologická metoda Hypofibrinogenemie (např. při akutní DIC) Hyperfibrinogenemie ( při zánětu, protein akutní fáze) TT - trombinový čas plazmy (normál 17 - 24 s). Přímé vyšetření konverze FBG na fibrin Prodloužen: dysfibrinogenemii, těžké hypo- afibrinogenemii vysoké hladině FDP (působí antipolymeračně) při heparinové terapii

Speciální vyšetření PKS Vyšetření aktivity jednotlivých faktorů PKS pomocí APTT testu s použitím selektivně deficitní plazmy - diagnostika hemofilie A (FVIII), B(FIX), C (FXI) a dalších deficiencí.

Metody vyšetření srážlivosti plné krve u lůžka Lee-Whiteův test - koagulační čas plné krve odebrané bez antikoagulancí v polystyrenové nebo skleněné zkumavce při 37oC. Normální hodnoty 4 - 10 min., dle uspořádání. Hrubý orientační test funkce PKS v akutních stavech. Trombinový čas plné krve - koagulační čas plné krve odebrané bez antikoagulancií ve zkumavce se standardním množstvím trombinu. Slouží pro rychlou orientační kontrolu přítomnosti fibrinogenu (+/-) v krvi při dekompenzaci akutní DIC. Aktivovaný koagulační čas (ACT) - krev odebraná bez antikoagulancia se aplikuje do zkumavky s kontaktním aktivátorem (silika, kaolin) a v přístroji je při 37oC míchána do odečtení času koagulace. Rutinní použití pro kontrolu heparinizace při mimotělním oběhu a hemodialýze. ACT normální krve je cca 150 s, při heparinizaci pro dlouhodobý MO nebo hemodialýzu 180 - 300 s, při MO v kardiochirurgii > 600 s.

Pravděpodobné výsledky laboratorních testů při různých poruchách hemostázy (I) Porucha PLT BT APTT PT TT FBG Trombocytopenie L P N N N N Hemofilie A N N P N N N Hemofilie B N N P N N N Hemofilie C N N P N N N vW choroba N P N/P N N N LA N N P N/P N N

Pravděpodobné výsledky laboratorních testů při různých poruchách hemostázy (II) Porucha PLT BT APT T PT TT FBG N N P P N N FV-def. FII-def. FVII-def. Vit.Kdef./OA FBG-def. Heparin N N N P P N N N P N N P N N P P N N N N P P P L N N/P P N N/P P

VÝUKOVÁ KAZUISTIKA- KOA 1 Žena, 55 let ve 26 letech, 10 dnů po III. porodu - DVT ldk, SVT pdk terapie - heparin, následně OA (warfarin) 6 měsíců v 41, 43 letech - 2 nekomplikované gyn. chirurgie (ov. cysta) v 45 letech - opak. epizody tachykardie - ECHO -mitr. stenóza v 46, 53, 54 letech - SVT dk Otázka: Jaké znáte doposud známé příčiny hereditárních a získaných trombofílií. Jaká laboratorní vyšetření navrhujete?

KOA 1/II protein S aktivita 52%, stanoven APC poměr - APTT test s a bez standardního přídavku APC. APC poměr = (APTT s APC/ APTT bez APC) = 2 - 5 normál = 1,15 pacientka DNA analýza F V: PCR fragmentu s nukleotidem 1691, restrikční enzym Mn1 zjištěna homozygotní mutace FV:Q506 Leiden . Otázka: Jaká je úloha aktivovaného proteinu C (APC) v PKS Popište funkci systému proteinu C. Jakou poruchu u pacientky předpokládáte ? Otázka: Vysvětlete princip APC-rezistence ?

KOA 1/III Regulace trombinové aktivity HPS AT T PKS T T TF AT FVa PS FVIIIa APC Protein C systém je esenciální pro regulaci trombinové aktivity. Aktivovaný trombin (T) reaguje na povrchu endotelu s receptorem trombomodulinem (TM). Trombin v komplexu s trombomodulinem ztrácí své prokoagulační aktivity a aktivuje v plazmě přítomný protein C. Aktivovaný protein C (APC) s kofaktorem proteinem S degraduje FV a FVIII PKS a tím se zpomaluje aktivace trombinu. Je to důležitá negativní zpětná vazba aktivace trombinu. Homozygotní PC deficienti zmírají v novorozeneckém věku na těžké trombozy a DIC, heterozygoti trpí trombofilií. U 3 - 5% populace se vyskytuje mutace FV 506 Arg - Glu, a zmutovaný FV 506 Glu (Leiden) je rezistentní vuči proteolýze APC. Vzniká tak dispozice k trombofilii. HPS PC TFPI PC T TM ENDOTEL

KOA 1/IV U pacientky náhlé epizody atriální fibrilace, ECHO - LA trombus, mitrální stenoza Kardiochir. výkon : trombektomie a náhrada mitrální chlopně. Zahájena dlouhodobá léčba orálními antikoagulancii s udržovanou hodnotou INR = 3,5 - 4,5. Otázka: jaký je princip terapie orálními antikoagulancii? Co je to INR? Jaké budou hodnoty základních koagulačních vyšetření u pacientky ?