Využití HPLC v analýze potravin HPLC aplikace

HPLC aplikace

HPLC aplikace

Stanovení přirozených složek potravin HPLC aplikace

Lipidy Nasycené a nenasycené triacylglyceroly – zpracování potravin Nízká stabilita triacylglycerolů obsahujících nenasycené mastné kyseliny Reakce se světlem a kyslíkem – vznik hydroperoxidů – ovlivnění chuti a kvality tuků Falšování přídavkem jiných tuků, použití ztužených tuků – stanovení obsahu triacylglycerolů (př. falšování olivového oleje) Stanovení triacylglycerolů, hydroperoxidů, sterolů a vitaminů UV-DAD spektra – stopy hydroperoxidů nasycené x nenasycené triacylglyceroly Př. nenasycené triacylglyceroly v olivovém oleji – charakteristické spektrum Příprava vzorku – extrakce petroletherem, rozpuštění v THF HPLC aplikace

Profil triacylglycerolů Starý slunečnicový olej Odezva při 240 nm – hyroperoxidy HPLC aplikace

Analýza olivového oleje 280 nm – konjugované dvojné vazby – špatná kvalita oleje HPLC aplikace

Profil triacylglycerolů v olivovém oleji HPLC aplikace

Mastné kyseliny Stanovení nenasycených mastných kyselin C4-C22 Př. máslo a margariny se liší v zastoupení kyseliny máselné v triacylglycerolech Stanovení jednotlivých mastných kyselin Hydrolýza (horký metanol a KOH), online derivatizace (bromid fenacylbromidu -zavedení chromoforu) - HPLC/UV HPLC aplikace

Složení tuku HPLC aplikace

Sacharidy Glukosa, galaktosa, rafinosa, fruktosa, mannitol, sorbitol, laktosa, maltosa, cellobiosa, sacharosa Nepřítomnost chromoforu nebo fluoroforu: nelze UV-VID nebo FLD RID – hladiny mg/kg Elektrochemická detekce - hladiny µg/kg Příprava vzorku (dle matrice): odplynění, filtrace, extrakce, SPE přečištění HPLC aplikace

Stanovení sacharidů HPLC aplikace

Vitaminy Přírodní i syntetické Zlepšení nutriční hodnoty potravin Ve vodě rozpustné vitaminy: C, B6, B2, B1, B12 V tuku rozpustné vitaminy: E, D, A Hladiny µg/kg Labilní (světlo, teplo) UV, DAD – kvalitativní i kvantitativní stanovení Elektrochemická detekce HPLC aplikace

UV detekce HPLC aplikace

Elektrochemická detekce Vitaminový přípravek HPLC aplikace

V tuku rozpustné vitaminy UV detekce HPLC aplikace

V tuku rozpustné vitaminy Elektrochemická detekce HPLC aplikace

Tokoferoly – normální fáze HPLC aplikace

Stanovení tokoferolů v extraktu margarinu FLD detekce HPLC aplikace

Biogenní aminy Stanovení biogenních aminů Volné aminy přítomny v potravinách a nápojích (ryby, sýry,víno, pivo) Maximální přípustné hladiny MRL derivatizace HPLC aplikace

Víno - po derivatizaci (dansyl chlorid) UV detekce Víno - po derivatizaci (dansyl chlorid) HPLC aplikace

Aminokyseliny Primární a sekundární aminokyseliny v jednom stanovení Stanovení původu masných výrobků – falšování potravin Chirální stacionární fáze stanovení D a L formy Automatická online derivatizace - předkolonová, FLD detekce Příprava vzorku: hydrolýza (HCL, enzym) HPLC aplikace

STANOVENÍ AMINOKYSELIN Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin - převedení aminokyselin, které jsou převážně vázané v bílkovinách, do formy volných aminokyselin Analytická koncovka – přesnost, správnost, rychlost HPLC Separace - ionexy (automatické analyzátory aminokyselin) reverzní fázi - oktadecyl (C18), gradientová eluce Detekce a kvantifikace – po předchozí derivatizaci Derivatizace před i za kolonou, UV i fluorescenční detekce    interní standard kompenzuje: nižší výtěžky derivatizační reakce         ztráty při přípravě vzorku          variabilní objem při nástřiku vzorku Jako vnitřní standardy se používají: norleucin, norvalin, -aminomáselná kyselina, -aminomáselná kyselina, -aminomáselná kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj. HPLC aplikace

Derivatizační činidla o-Phthaldialdehyd (OPA) 9-fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) Ninhydrin Dansylchlorid AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamát) Phenylisothiokyanát (PITC) HPLC aplikace

o-Phthaldialdehyd (OPA) Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti merkaptoethanolu s primárními aminokyselinami - rychlá, za laboratorní teploty Výhoda - sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenci excitační maxima 340 nm, emisní maxima 450 nm Nevýhoda - reaguje pouze s primárními aminokyselinami HPLC aplikace

Separace OPA derivátů aminokyselin Chromatografické podmínky Gradient: solvent A: 15 mM Na2HPO4 pH 7,2/tetrahydrofuran (96+4); solvent B: 15 mM Na2HPO4/CH3OH/CH3CN (40+36+24). Průtok: 3,5 ml/min; program: 0-100 % B/A, 27 min. Kolona: Radial Pak 5 m C18 cardtridge. HPLC aplikace

Porovnání vlastností jednotlivých derivatizačních činidel používaných k derivatizaci aminokyselin Charakteristika OPA FMOC-Cl Ninhydrin Dns-Cl AQC PITC Detekce FLD UV UV (FLD) Citlivost fmol mol pmol (nmol) pmol Stabilita derivátu špatná dobrá -- střední Rychlost derivatizace rychlá malá Sekundární aminokyseliny ne ano Interference reagentu Interference matrice malý vysoký HPLC aplikace

Stanovení aminokyselin v pivu po derivatizaci (OPA) HPLC aplikace

Stanovení aminokyselin v bramborách (HPLC/FLD v reverzní fází, derivatizace OPA) Podmínky stanovení: analytická kolona: MERCK, LichroCART (250x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5m) analytická předkolona: MERCK, LichroCART (4x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 m) teplota kolony: 30 °C mobilní fáze: 0,01 M Na2HPO4; 0,013 mM Na2EDTA; methanol (Merck); pH 6,4 gradientová eluce: 0 – 15 min. 28 - 50 % methanolu 15 -20 min. 50 % methanolu průtok: 0,7 ml/min nástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo v nástřikové smyčce desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonu FLD detektor: ex = 340 nm; em = 455 nm HPLC aplikace

D,L-alanin Chirální separace optických izomerů kolona : 25 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil Chiral-1 eluent : 1 mM vodný roztok (CH3COO)2Cu (pH = 5,6) průtok eluentu : 1,2 ml/min teplota : 60 ˚C detekce : UV 240 nm 1. D-alanin 2. L-alanin HPLC aplikace

Bílkoviny kolona : 25 cm x 9,4 mm stac. fáze : Zorbax GF-250 eluent : 130 mM NaCl + 20 mM KCl + 50 mM Na2HPO4 (pH = 7,0) průtok: 1 ml/min detekce : UV 210 nm      1. myší IgM, Mh = 900 000      2. hovězí thyroglobulin, Mh = 669 000      3. β-amylasa z brambor, Mh = 200 000      4. hovězí serum albumin, Mh = 66 000      5. kuřecí albumin, Mh = 45 500      6. hovězí RNAasa, Mh = 13 700      7. azid (tmax), Mh = 65 HPLC aplikace

Stanovení peptidů fytochromu V semenech ovsa rostoucích ve tmě HPLC/UV a MS detekce UV mapování HPLC aplikace

TIC Stanovení peptidů fytochromu semena ovsa rostoucí ve tmě LC-MS MS spektrum T12 a T58 HPLC aplikace

Deriváty purinu kolona : 30 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil 50-5 eluent : methanol-voda-dichlormethan 47:17:936 (v/v/v) průtok: 0,8 ml/min detekce: UV 280 nm 1. kofein 2. theofyllin 3. theobromin HPLC aplikace

HPLC/UV analýza fytoestrogenů (po SPE přečištění) přečištění SPE bez přečištění HPLC aplikace

Mez kvantifikace (LOQ) Stanovení glykoalkaloidů v rajčatech LC-MS/MS Porovnání HPLC-UV a LC-MS/MS metody HPLC-UV a LC-MS/MS chromatogram vzorku R40 (zelené rajče) LC-MS/MS 20x nižšího LOD, lepší opakovatelnost a výtěžnost ve srovnání s HPLC-UV (vhodná pro zralá rajčata) Parametry metody HPLC-UV LC-MS/MS Analyty Tomatin Dehydrotomatin Opakovatelnost 4% Nelze stanovit 2,6% 3,1% Výtěžnost 85,0% (100 mg/kg) 94,4% (9 mg/kg) 82,9% (0,9mg/kg) Detekční limit (LOD) 2 mg/kg 0,1 mg/kg 0,05 mg/kg Mez kvantifikace (LOQ) 6 mg/kg 0,3 mg/kg 0,15 mg/kg HPLC aplikace

Potravinářská aditiva HPLC aplikace

Acidulanty a regulátory kyselosti Kyselina sorbová a citrónová Octová, propionová, jantarová, adipová, mléčná, fumarová, jablečná, vinná kyselina Ochucovadla - zintenzivnění chuti, maskování nežádoucích pachutí Pufrování – kontrola pH (zpracování potravin, finální výrobky) Konzervační prostředky, zamezení růstu mikroorganismů Prevence žluknutí a hnědnutí – antioxidační účinky Úprava viskozity pečených výrobků Přídavky při tavení - tavené sýry, cukrovinky Zlepšení barvy a chuti při konzervování masa Destilace s vodní parou, SPE HPLC UV/DAD HPLC aplikace

Bílé víno HPLC aplikace

Citrónová kyselina ve vodce HPLC aplikace

Antioxidanty HPLC aplikace

HPLC/UV-VIS (DAD) antioxidantů Žvýkačka HPLC aplikace

Konzervační prostředky Benzoová kyselina Sorbová kyselina Propionová kyselina Methyl-, ethyl-, propyl- estery p-hydroxy benzoové kyseliny (PHB.methyl, PHB-ethyl, PHB-propyl Inhibice růstu mikroorganismů Prodloužení životnosti potravin HPLC aplikace

HPLC/UV-VIS (DAD) HPLC aplikace

Umělá sladidla Acesulfam Aspartam Sacharin Nízkokalorická sladidla: nápoje Regulace hladin – legislativa Možný toxický účinek HPLC aplikace

On-column derivatizace, PR chromatografie Aspartam On-column derivatizace, PR chromatografie Srovnání spektra derivatizovaného (OPA) a nederivatizovaného aspartamu HPLC aplikace

Syntetická barviva Použití: při zpracování potravin ve farmaceutickém průmyslu v chemickém průmyslu Zakrytí kazů, zvýraznění barvy potravin, zamaskování vlivů zrání a stárnutí Zlepšení přitažlivosti potravin Kontrola kvality, stanovení stopových koncentrací původních látek a degradačních produktů – vývoj citlivých a selektivních analytických metod HPLC/UV-VIS - charakteristická maxima 400 nm (žlutá) – 500 nm (červená) – 600 – 700 nm (zelená, modrá, „černá“) HPLC aplikace

Syntetická barviva v limonádě Spektra žlutého, červeného, modrého a „černého“ barviva HPLC aplikace

Ochucovadla Zlepšení chuti potravin Nejčastěji použité látky: Esenciální oleje (silice), hořké látky, ostré pálivé látky Příklady: Lupulon a humuklon (hořké látky chmele) Vanilin Naringenin a hesperidin (hořké látky) Nejčastěji používaná metoda: GC (head-space, SPME) HPLC – málo těkavé látky, tepelně nestabilní látky HPLC aplikace

Kvalita extraktu vanilinu HPLC/UV, RP Kvalita extraktu vanilinu HPLC aplikace

Stanovení vanilinu v koňaku Identifikace srovnáním spekter HPLC aplikace

Hořké látky: hesperidin a naringenin Pomerančový džus HPLC/UV, RP HPLC aplikace

Rezidua a kontaminanty HPLC aplikace

Aplikace v reziduální analýze Analýza stopových množství sledovaných látek: - vysoká citlivost analytické metody - nízké meze stanovitelnosti (závisejí na citlivosti a šumu použitého detektoru, na zředění látky při průchodu kolonou a na rušivých vlivech daných složkami mobilní fáze či kontaminanty v mobilních fázích nebo v analyzovaném vzorku. Pro ideální (gaussovský) profil píku lze odvodit vztah mezi výškou píku, zaznamenaného detektorem, a koncentrací látky ve vzorku, dávkovaném do chromatografu, Zlepšení citlivosti - ovlivnění faktorů na pravé straně rovnice, tak aby byla výška píku maximální. Snížení mezí detekce - zvýšení odstupu signálu od šumu Snížení šumu - termostatovaná kolona a cela detektoru, použití čerpadel se stabilním hladkým průtokem, mobilních fází připravených z velmi čistých složek (zejména při gradientové eluci), důkladně odplyněných a přečištěním vzorku HPLC aplikace

Nejčastější aplikace Stanovení reziduí léčiv (stanoveny MRL) (dobytek drůbež, maso, mléko, vejce …; působení rezistence) Chemoterapeutika (sulfonamidy, antibiotika …) Antiparazitika hormony Mykotoxiny Polyaromatické uhlovodíky Pesticidy Příklady: HPLC aplikace

Rezidua léčiv ve vzorcích vajec HPLC/UV-VIS (DAD); RP HPLC aplikace

Stanovení reziduí tetracyklinů v mase HPLC/UV-VIS (DAD); RP LOD 0,1 mg/kg HPLC aplikace

Fumonisiny - Fusarium monoliformae LC/MS Mykotoxiny: Fumonisiny - Fusarium monoliformae LC/MS MS spektra fumonisinu B1, 2, 3 HPLC aplikace

Identifikace fumonisinů ve vzorcích kukuřice, Následná konfirmace dle fragmentových iontů HPLC aplikace

Mykotoxiny HPLC aplikace

Mykotoxiny HPLC aplikace

Mykotoxiny Aflatoxiny HPLC UV/FLD HPLC aplikace

HPLC/FLD stanovení zearalenonu Porovnání přečištění pomocí SPE a GPC Zearalenon manuálně x ASPEC SPE - výtěžnost 109 % 92 % SPE - opakovatelnost 31 % 3 % HPLC aplikace

Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt z tuňáka; 0,2 mg/kg; 1 μl nástřik HPLC aplikace

Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt ze sardinek; 20 mg/kg; 1 μl nástřik HPLC aplikace

Pesticidy Rezidua pesticidů ve vzorku salátu Carbendazim – výtěžnost pouze 40% HPLC aplikace

Stanovení reziduí pesticidů ve vzorcích papriky HPLC aplikace

Karbamáty Nesystémové insekticidy HPLC/FLD Pokolonová derivatizace (OPA/NaOH) Materiál: ovoce, zelenina HPLC aplikace

Karbamáty Analýza standardů HPLC aplikace

Glyfosát Standard systémový herbicid HPLC/FLD Pokolonová derivatizace HPLC aplikace

FUNGICIDY Extrace z ovoce: dichlormetan Kolona: Nucleosil 7 C18 eluent : 5 g/l kys. mravenčí + NaOH (pH 7,5) 40 % se 60 % methanolu 1. thiabendazol 2. o-fenylfenol 3. Difenylamin 4. Ethoxychin 5. bifenyl HPLC aplikace

PAH HPLC/DAD UV spektrum HPLC aplikace

Parametry DAD a FLD stanovení HPLC aplikace

LOD: DAD, FLD HPLC aplikace

IDENTIFIKACE / KVANTIFIKACE - HPLC/FLD (po GPC přečištění) olej, 10 mg matrice v nástřiku jablka, 250 mg matrice v nástřiku ex/em 216/336 nm ex/em 216/336 nm HPLC aplikace