Michaela Šváchová Ústav patologie FN Olomouc Molekulárně biologická analýza klonální přestavby IgH B-buněk a TCR T-buněk metodou PCR Michaela Šváchová Ústav patologie FN Olomouc

Klonalita detekce klonality – diagnostika a klasifikace lymfoproliferativních onemocnění polyklonalita – normální stav organizmu (benigní), přítomnost velkého počtu klonů s odlišnými přestavbami, schopné reagovat na velké množství antigenů monoklonalita – patologický proces (maligní), nádorové proliferace odvozené od jedné transformované buňky, stejná genetická výbava B- a T-lymfomy – populace s monoklonální přestavbou IgH B-buněk a TCR T-buněk

B- a T-lymfocyty Lymfocyty – vznikají v kostní dřeni z pluripotentních kmenových buněk (lymfoidní linie) Vývoj a diferenciace – B-lymfocyty – v embryonálních játrech v kostní dřeni T-lymfocyty – v thymu Jeden lymfocyt – jediná protilátka B-lymfocyty – humorální imunitní reakce (produkují imunoglobuliny) T-lymfocyty – buněčná imunita (vytvářejí antigen-specifické receptory na povrchu buňky)

Detekce klonální přestavby IgH B-buněk a TCR T-buněk u maligních lymfomů IgH B-buněk a TCR T-buněk genové segmenty (subgeny) přeskupení subgenů (VDJ rekombinace) funkční strukturní gen funkční polypeptidové řetězce IgH a TCR VDJ rekombinace – unikátní klonální marker PCR – k detekci klonální přestavby u lymfoproliferativních onemocnění

Struktura imunoglobulinu Ig – 2 těžké (H) a 2 lehké (L) polypeptidové řetězce o stejné primární struktuře Spojeny disulfidovými vazbami Konstantní oblasti (C) – relativně neměnná sekvence AA Variabilní oblasti (V) – jednotlivé imunoglobuliny příslušného typu těžkého nebo lehkého řetězce se navzájem liší sekvencí AA Variabilní oblast – FR I-IV tzv. úseky struktury základní (framework) CDR I-III hypervariabilní úseky, (complementarity determining region), oblasti určující komplementaritu, vazebná místa pro antigen

T buněčný receptor TCR – heterodimer, spojuje disulfidovou vazbou glykoproteinové řetězce αβ nebo γδ Většina T lymfocytů exprimuje na svém povrchu αβ řetězce, buňky exprimující γδ tvoří asi 5% T buněčné populace Jednotlivé buňky exprimují buď αβ nebo γδ heterodimery Řetězce tvořeny V a C doménami (kódované přeskupenými subgeny)

B-lymfocyt T-lymfocyt IgH TCRD Igκ exprese IgH/Igκ TCRG exprese TCRγδ delece Igκ Igλ exprese IgH/Igλ Izotypická exkluze T-lymfocyt TCRD TCRG exprese TCRγδ delece TCRD TCRB TCRA exprese TCRαβ

Imunoglobulin a přeskupení subgenů Ig subgeny – lokalizovány na chromozomech 2, 22, 14 TCR subgeny – 14, 7 V – subgeny kódují variabilní oblast C – subgeny kódují konstantní oblast J – subgeny kódují 12-21 koncových AA variabilní oblasti D – subgeny – každý kóduje asi 5 AA CDRIII úseku VJ somatická rekombinace – – κ a λ Ig řetězce – α a γ TCR VDJ somatická rekombinace – – IgH – β a δ TCR

VDJ rekombinace Přeskupení TCR β Rekombinace subgenů V, D a J řízena RAG1 a RAG2 rekombinázovými enzymy RAG1 a RAG2 rozpoznávají specifické DNA sekvence RSS (rekombinační signální sekvence), lokalizované po obou stranách přeskupujících se subgenů RSS obsahují heptamery a nonamery, oddělené od sebe 12 nebo 23 páry bazí, kde dochází ke štěpení DNA a k ligaci vytvořených kódujících spojů Vytvoření funkčního Ig nebo TCR genového produktu Přeskupení TCR β

Zpracování bioptických vzorků, izolace DNA Biopsie, tkáň fixovaná formalínem a zalitá do parafínu Odparafínování xylenem, promytí a odstranění xylenu etanolem Izolace DNA pomocí Puregene DNA Purification Kit Lýza buněk – lyzační pufr a proteináza K, inkubace přes noc při 56°C Odstranění RNA inkubací lyzátu s RNázou při 37°C Odstranění (vysrážení) proteinů přidáním precipitačního roztoku Vysrážení DNA izopropanolem Promytí DNA 70% etanolem, odpaření etanolu Hydratace DNA hydratačním pufrem Kontrola kvality a množství DNA měřením na spektrofotometru při 260 a 280 nm Kontrolní PCR k ověření integrity a amplifikovatelnosti vyšetřované DNA

Kontrolní PCR -zjištění integrity a amplifikovatelnosti vyšetřované DNA DNA MARKER DNA MARKER 400 bp 400 bp 300 bp 300 bp 200 bp 200 bp 100 bp 100 bp

Polymerázová řetězová reakce PCR Metoda pro mnohonásobnou amplifikaci specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace Reakční směs obsahuje: - templátovou DNA - primery (oligonukleotidy) - dNTP (směs nukleotidů) - PCR vodu - PCR pufr - roztok MgCl2 - enzym – termostabilní DNA polymerázu, vyznačující se 5´→3´polymerázovou a 3´→5´exonukleázovou aktivitou

PCR-Polymerázová řetězová reakce Amplifikace hypervariabilních oblastí VDJ Primery – specifické ke konzervovaným oblastem FR1 – FR3, JH Multiplex PCR – použití více párů primerů, nutná optimalizace z důvodu možné kompetice mezi primery Nested PCR – odstupňovaná PCR, vyšší specifita, primární produkt získaný pomocí 1. sady vnějších primerů je amplifikován pomocí 2. sady vnitřních primerů Seminested PCR – jeden z párů primerů je použit v 1. i 2. kole PCR VH DH JH FR2 JH2 FR3 JH1 JH primers N FR1 FR4 CDR1 CDR2 CDR3 FR1 CDR1 FR1

Stanovení klonality T-buněk monoklonální band DNA MARKER + - --- + - + - 200 bp 100 bp 75 bp Vγ11-Jγ11 TβD1-TβJ2 TβD2-TβJ2

Stanovení klonality B-buněk monoklonální band DNA MARKER +++ + - + + - + + - 500 bp 300 bp 200 bp 100 bp FR1 FR2 FR3

Interpretace a limitace výsledků PCR Polyklonalita – smear Monoklonalita – band Monoklonalita na polyklonálním pozadí – příměs reaktivních buněk Bialelické přeskupení – obě alely – dva bandy Klonalita nemusí znamenat malignitu „Lineage infidelity“ – fenomén nevěry k příslušné buněčné linii (prekurzorová B-ALL, AML) Pseudoklonalita (vysoká senzitivita PCR může způsobit amplifikaci několika málo přeskupení, což může být chybně interpretováno jako klonální přeskupení) Falešně negativní výsledky – chybné nasedání primerů např. v důsledku mutací vyšetřované DNA Falešně pozitivní výsledky – využití heteroduplexní analýzy

Heteroduplexní analýza PCR produktu denaturace 5 min při 94°C rychlá náhodná renaturace 1 hod při 4°C indukce homo nebo heteroduplexních formací heteroduplexy – různá migrační rychlost – polyklonální lymfoproliferace homoduplexy – identická migrační rychlost – monoklonální proliferace před po

Srovnání barvení EtBr × GelRed

Závěr Záchytnost metody – 60-100% odhalených skutečně klonálních lymfoproliferací (závisí na vlastnostech analyzované tkáně) Vysoký záchyt – B-chronická lymfatická leukémie, leukémie z vlasatých buněk, lymfom z plášťových buněk Nižší záchyt – folikulární lymfom, difuzní velkobuněčný B-lymfom (důsledek somatických hypermutací u germinálních a postgerminálních lymfomů) Citlivost metody – odhalení klonality v případě výskytu alespoň 5% buněk s klonální přestavbou ve vyšetřovaném vzorku Kvalita vyšetřované tkáně – způsob zpracování (fixace formalínem – degradace DNA, cross reakce mezi vlákny DNA, sekvenční alterace atd. – selhání PCR) vhodnější tkáň nativní, mražená, příp. fixovaná fixativy na bázi etanolu

Fixace tkáně /nekropsie/ DNA marker myokard prostata uzlina ledvina uzlina sval játra plíce VAKUUM 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp FFPE 200 bp 100 bp