HISTORIE ENZYMOLOGIE 1. Berzelius (18.stol.) – v rostlinách i živočiších probíhají tisíce katalyzovaných reakcí – FERMENTY – fermentace (Fabrony) 2. W.Kühne – en zýme = v kvasnicích – enzymy 3. J. Sumner (1926) – prokázána bílkovinná povaha enzymů

HISTORIE Katalytický účinek enzymů: a) teorie komplementarity – E. Fischer (1894) – představa o vzniku komplexu enzym- substrát b) V.Henri (1902) – představa o vzniku meziproduktu enzym-substrát Michaelis a Mentenová – kinetika jednosubstrátových reakcí (1913)

HISTORIE 1814 – první enzym – AMYLASA ze sladu SLINNÁ AMYLASA 1830 – 1840 – žaludeční proteasa – PEPSIN - dnes známo cca 3000 různých enzymů

základ existence života ENZYMY základ existence života

CHARAKTERISTIKA 1. Enzymy – ve všech živých systémech. 2. Nejjednodušší buňky – obsahují přes 3000 enzymů. 3. Jeví druhovou specifitu. 4. Veškerá existence života – založena na existenci enzymů. 5. Aktivita enzymů – pružně regulovatelná dle měnících se potřeb organismu.

ENZYMY předčí umělé katalyzátory: 1. Jsou účinnější – 1 molekula enzymu je schopna přeměnit až 5.10 na 4 molekul substrátu – což je spojeno se značnou reakční rychlostí (vyšší o několik řádů než u umělých katalyzátorů). 2. Vykazují značnou specifitu jak co do typu katalyzované reakce, tak co do substrátů struktury přeměňovaných

ENZYMY předčí umělé katalyzátory: 3. Pracují za mírných podmínek: teplota 20-40°C, tlak 0,1 MPa, pH většina kolem 7. 4. Jejich účinek lze snadno regulovat, dokonce na několika úrovních. 5. Jsou netoxické, na rozdíl od uměle vyrobených enzymů.

Jak za tyto přednosti platí živá příroda? - složité struktury enzymů jsou citlivé k řadě vlivů - enzymy podléhají poměrně rychlému opotřebení - podle potřeb regulace jsou stále odbourávány a znovu syntetizovány

AKTIVAČNÍ ENERGIE – katalyzátory reakcí

KLASIFIKACE A NÁZVOSLOVÍ ENZYMŮ Enzymová komise Mezinárodní unie biochemnie (IUBMB- 1961) – vedle triviálních názvů (pepsin, trypsin, kathepsin,..) i systémové názvosloví (EC klasifikace) - hlavním hlediskem je TYP KATALYZOVANÉ REAKCE: dělení do 6 tříd

TŘÍDY ENZYMŮ 1. OXIDOREDUKTÁZY - katalyzují intramolekulární a oxidačně- redukční reakce, mají povahu složených bílkovin - oxidačně-redukční děje se realizují buď: přenosem atomů VODÍKU - dehydrogenázy nebo ELEKTRONŮ - transelektronázy

TŘÍDY ENZYMŮ 2. TRANSFERÁZY realizují přenos skupin – CH3, - NH2, ... v aktivované formě z jejich donoru na akceptor mají povahu složených bílkovin dělí se na podtřídy dle charakteru přenášených skupin

TŘÍDY ENZYMŮ 3. HYDROLÁZY hydrolyticky štěpí vazby, které vznikly kondenzací například PROTEASY štěpí peptidickou vazbu v molekule proteinů a peptidů 4. LYASY - katalyzují nehydrolytické štěpení a vznik vazeb C-C, C-O, C-N

TŘÍDY ENZYMŮ 5. ISOMERAZY realizují vnitromolekulární přesuny atomů a jejich skupin – vzájemné přeměny isomerů - nejméně početná třída typ jednoduchých bílkovin dělení na podtřídy podle typu isomerie

TŘÍDY ENZYMŮ 6. LIGASY ( triviální názen SYNTHETASY) katalyzují vznik energeticky náročných vazeb za současného rozkladu ATP málo početná třída – uplatňuje se při biosyntézách povaha složených bílkovin dělení podle vytvářených vazeb

VYJÁDŘENÍ KATALYTICKÉ ÚČINNOSTI ENZYMŮ 1972 – definována nová jednotka – KATAL 1 kat – představuje množství katalyzátoru, který přemění za standardních podmínek za 1 sekundu 1 mol substrátu - v praxi se používají zlomky této jednotky : mikrokatal, nanokatal

STRUKTURA MOLEKUL ENZYMŮ enzymy : 1.globulární bílkoviny + 2.kofaktor KOFAKTORY – nízkomolekulární struktury, které většinou obsahují heterocyklus Funkce: přenos atomů, skupin atomů a elektronů při biochemických reakcích, které enzymy katalyzují.

VAZBA KOFAKTORU A ENZYMU 1. Je-li kofaktor vázán pevnou vazbou (kovalentní) – stabilní součást molekuly – tvoří prostetickou skupinu (př. hem u transelektronáz cytochromů) 2. Je-li kofaktor vázán slabou vazbou – tvoří tzv. koenzym

PŘEHLED KOFAKTORŮ klasifikace dle jejich funkcí 1. PYRIDINOVÉ (NIKOTINAMIDOVÉ) - nejdéle známé (1906) NAD +, NADP+ - součástí jejich molekul je niacin – vit. B - známo cca 250 enzymů s těmito kofaktory, jsou povahy transhydrogenas – odnímají substrátům dvojici atomů vodíku

PRĚHLED KOFAKTORŮ FAD, FMN 2. FLAVINOVÉ (ŽLUTÉ) struktura 1933 - součástí jejich struktury je riboflavin – vit B2 účastní se redoxních reakcí oxidací jsou substrátem odebírány 2H za vzniku = vazby, v této formě jsou žluté při redukci jsou 2H přijímány a vytváří se bezbarvá leuko forma kofaktorů FADH2, FMNH2

PŘEHLED KOFAKTORŮ 3. alfa – LIPOÁT objeven 1950 jako růstový faktor určitých mikroorganismů je součástí některých transhydrogenás reakce za účasti tohoto kofaktoru jsou součástí komplexního děje : OXIDAČNÍ DEKARBOXYLACE alfa-OXOKYSELIN

PŘEHLED KOFAKTORŮ 4. UBICHINONY - fungují v organismu jako časté akceptory atomů vodíku patří mezi ně např. koenzym Q (Co-Q) jsou součástí mitochondriálních dýchacích řetězců dalším příkladem je plastochinon – účastní se světelné fáze fotosyntézy

PŘEHLED KOFAKTORŮ 5. ATP – adenosintrifosfát kofaktor má nukleotidovou strukturu triviálním názvem se označují jako KINASY přenášejí za odštěpení ADP fosforylovou skupinu

LOKALIZACE ENZYMŮ Dle místa působení: 1. INTRACELULÁRNÍ jsou a zůstávají uvnitř buňky, ve které vznikly mohou být vázány v různých biologických strukturách mnohé z nich jsou pouze v některých orgánech (popř. organelách) 2. EXTRACELULÁRNÍ - jsou buňkami, které je vytvořily vylučovány - nacházejí se ve tkáňových kapalinách (žaludeční šťáva, krev, mozkomíšní mok,…)

FORMY ENZYMŮ - některé enzymy jsou syntetizovány v inaktivním stavu – PROENZYMY - jsou dopraveny z místa vzniku do místa působení a jejich aktivaci umožní jiná látka (lipásy alkalické prostředí duodena) ISOENZYMY – různé formy určitého enzymu, který se postupně nahrazuje během vývoje organismu (chymosin pepsin)

ENZYMATICKÉ REAKCE reakce enzymů se odehrávají v malé oblasti molekuly enzymu – 1. AKTIVNÍ CENTRUM do tohoto místa se váží substráty na výstavbě katalytického centra se účastní několik skupin: a) katalytické aktivní skupiny – tvoří katalytické centrum b) skupiny, jejichž úkolem je specificky vázat substrát – vazebné centrum

ENZYMATICKÉ REAKCE c) další skupiny, které tvoří vhodné chemické prostředí v centru a vhodnou prostorovou strukturu Vedle aktivního centra jsou v molekule enzymů další významné oblasti pro funkci těchto biokatalyzátorů – tyto oblasti – 2. AKTIVAČNÍ MÍSTA

PRŮBĚH ENZYMATICKÉ REAKCE - v oblasti aktivního centra jsou reakce ASYMETRICKÉ – tzn., že připojování struktury se blíží k molekule substrátu z jednoho směru a odštěpované části odcházejí z komplexu enzym-substrát v druhém směru

MECHANISMUS ÚČINKU ENZYMŮ Názory na mechanismus účinků enzymů vychází ze dvou představ: 1. Představa teorie komplementarity (též systém zámek a klíč) - formuloval E. Fischer 1894 – do aktivního centra zapadne pouze substrát o vhodné velikosti a tvaru molekuly

MECHANISMUS ÚČINKU ENZYMŮ 2.Teorie Michaelise a Mentenové ( poč. 20. století) základem je předpoklad, že molekuly enzymů vážou substrát za tvorby meziproduktu existence meziproduktu se stala výchozím bodem pro objasnění mechanismu působení enzymů

KINETIKA ENZYMATICKÝCH REAKCÍ Vysvětlení kinetiky enzymatických reakcí: 1. Schéma průběhu enzymatické reakce 2. Saturační křivka – křivka závislosti rychlosti enzymatické reakce na koncentraci substrátu

SATURAČNÍ KŘIVKA

MICHAELISOVA KONSTANTA Michaelisova konstanta - KM - nezávisí na koncentraci enzymu - závisí na prostředí (pH, teplota,...) - hodnoty konstanty mají široké rozmezí – pro většinu enzymů 10-1 až 10-6 mol/l - čím je hodnota KM nižší, tím je afinita enzymu k danému substrátu vyšší

VÝZNAM KM - umožňuje odhadnout koncentraci substrátu nutnou pro dosažení limitní rychlosti reakce - umožňuje vypočítat počáteční rychlost enzymatické reakce pro danou koncentraci substrátu

VLIV REAKČNÍCH PODMÍNEK NA ÚČINNOST ENZYMŮ 1. Koncentrace substrátu - rychlost reakce vrůstá s koncentrací substrátu tak dlouho, dokud se neobsadí všechna aktivní centra enzymu 2. Množství enzymu - rychlost reakce se zvyšuje přímo úměrně s množstvím enzymu

VLIV REAKČNÍCH PODMÍNEK NA ÚČINNOST ENZYMŮ 3. pH prostředí optimální oblast pH (pH= 5-7), kde je jejich účinnost nejvyšší pH optimum úzké: pepsin: pH 1-2 pH optimum široké: chymotrypsin: pH 8-11 4. teplota prostředí - rychlost reakce roste se vzrůstající teplotou, při teplotě 45-50°C se rychlost zastavuje a začíná klesat

OVLIVNĚNÍ ÚČINNOSTI ENZYMŮ - enzymatické reakce ovlivňují EFEKTORY (modifikátory) pozitivní efektory – AKTIVÁTORY - látky, které se vážou na molekulu enzymu vratně (např. ionty kovů) látky snižující aktivitu enzymů - INHIBITORY – brzdí enzymatické reakce ( ionty anorganických látek, nízkomolekulární látky, antibiotika, kolchicin,...)

OVLIVNĚNÍ ÚČINNOSTI ENZYMŮ Inhibitory vyvolávají buď změnu struktury molekuly enzymu nebo konkurují v působení na aktivní centrum substrátu

Inhibitory dělíme z hlediska mechanismu působení: a) kompetitivní inhibitory – inhibitor se váže na aktivní centrum enzymu a zabraňuje tak substrátu vytvořit komplex enzym-substrát b) nekompetitivní inhibitory - inhibitor pevně blokuje reaktivní skupiny aktivního centra enzymu (např. – SH, -OH) - tento účinek mají například ionty těžkých kovů (Hg, Pb, Cu – tzv. katalytické jedy)

PROTEOLYTICKÉ ENZYMY - PROTEÁZY - nejvíce prostudované enzymy - katalyzují hydrolýzu bílkovin, peptidů, amidů esterů a aminokyselin - dělení : 4 skupiny dle mechanismu účinku

SKUPINY PROTEÁZ SERINOVÉ PROTEÁZY (též – OH proteázy nebo trávicí enzymy) - zásadité pH - trypsin, chymotripsin, - elastáza, trombin, - mikrobní proteázy

SKUPINY PROTEÁZ 2. CYSTEINOVÉ PROTEÁZY (thiolové proteázy) - jako katalytickou skupinu používají thiolovou skupinu zbytku cysteinu - neutrální pH a) rostlinné: papain, ficin, bromelain b) živočišné: cathepsin B c) mikrobní: streptokoková proteáza

SKUPINY PROTEÁZ 3. ASPARTÁTOVÉ PROTEÁZY - kyselé pH ( dva karboxyly – jeden donorem, druhý akceptorem) - pepsin, chymosin, plísňové proteázy 4. METHALOPROTEÁZY - typická tvorba komplexu s kovem - karboxypeptidáza A - lucinaminopeptidáza (Zn)