Nemoci způsobené patologickou konformací proteinů Amyloid Alice Skoumalová

Teoretický model zavinování: (hiearchický) tvorba lokálních sekundárních struktur tvorba terciárních struktur (subdomény, domény) stabilní konformace

Termodynamický model skládání proteinu: Lokální minima (alternativní konformace) Globální minimum (nativní stav) Protein se skládá tak, aby byla co nejmenší jeho volná energie Existuje však několik alternativních konformací ! Alternativní konformace: Různé funkce proteinu Patologický protein

Normální protein (nativní struktura) α-helix β-skládaný list konformační změna Normální protein (nativní struktura) Protein způsobující onemocnění (patologická konformace) Agregace Toxická aktivita Ztráta funkce Konformační změna: změna sekundární, terciární a kvartérní struktury proteinu, aniž by se změnila primární struktura protein získává toxickou aktivitu nebo ztrácí přirozenou funkci

Nemoci způsobené patologickou konformací protein (PCD) = nemoci vyplývající z poruch konformace proteinů Společný znak nemocí způsobených patologickou konformací proteinů je tvorba struktur β-skládaného listu Tvorba β-skládaného listu je obvykle stabilizována oligomerizací a agregací proteinu Důsledkem tohoto procesu vznikají depozita amyloidu podobných agregátů v nejrůznějších orgánech, dochází k jejich poškození a ztrátě funkcí Konformační defekt způsobuje nemoc! (nemoci způsobené patologickou konformací proteinů)

Nemoci Proteiny Alzheimerova choroba Amyloid-β Parkinsonova choroba α-Synuclein Diabetes mellitus typ II. Amylin Amyotrofická laterální sklerosa Superoxid dismutasa Amyloidosa spojená s hemodialisou β2-mikroglobulin Cystická fibrosa Cystická fibrosa transmembránový regulátor (chloridový kanál) Srpkovitá anémie Hemoglobin Hungtingtonova choroba Huntingtin Creutzfeldt-Jakobova nemoc Prion protein Amyloidosy 10 různých proteinů

Hypotézy patogeneze PCD: Polymerizační hypotesa agregace nastartuje konformační změny proteinů Konformační hypotesa konformační změny jsou nezávislé na agregaci, která může následovat Konformačně-oligomerizační hypotesa strukturální změny vedou ke vzniku nestabilního intermediátu, který spouští oligomerizaci, a ta je nutnou podmínkou pro stabilizaci konformačních změn

Osud proteinu s patologickou konformací: Creutzfeldt-Jakobova nemoc Rozpoznání Alzheimerova choroba Degradace (systém kontroly kvality proteinů) 1.Chaperony 2. Systém ubikvitin proteasom

Systém kontroly kvality proteinů Protein quality control in the cell Interplay of molecular chaperones and proteases in the cell. Substrate proteins are shown in red; an ATP-dependent chaperone, such as GroEl, is shown in bluse; a Clp chaperone is purple and is associated with a compartmentalized protease shown in green. Molecular chaperones play a critical role in protein quality control during the course of cell growth as well as during stress conditions. Normal protein synthesis produces nascent unfolded proteins. Although some nascent polypeptides are able to fold spontaneously (1), others require the action of molecular chaperones, icluding members of the DnaK/Hsp70 and GroEL/Hsp60 families, to facilitate folding (2). Unfolded and misfolded proteins also arise in cells as a result of environmental stresses, such as heat shock, or pathologic conditions, such as inflammation, tissue damage, infection, and genetic diseases involving mutant proteins. Molecular chaperones are able to refold and reactive some misfolded proteins (2). Ther irreversibly misfolded proteins are recognized by the proteasome. These multicomponent proteases use associated chaperones to unfold and deliver damaged proteins to the proteases for degradation (3). Finally, proteins that are neither refolded nor degraded form insoluble aggregates in the cell (4). Aggregates are not always an end product, but can be dissolved by molecular chaperones.

Ukládání (Amyloidosy) Ubikvitin Ribosom RNA ATP Chaperony Nativní protein Protein s patologickou konformací Agregát/fibrilární amyloid Chaperony Proteasom Ukládání (Amyloidosy) Degradovaný protein Toxická bílkovina (Alzheimerova choroba) Ztráta funkce (Cystická fibrosa)

Důsledek patologické konformace proteinů Vznik toxické bílkoviny Neurodegenerativní onemocnění (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Hungtingtonova choroba) chronická, progresivní onemocnění ztráta neuronů, kumulace patologických proteinů a vznik agregátů Ztráta funkce Cystická fibrosa mutace genu pro chloridový kanál Ukládání Amyloidosy fibrily nejsou toxické, ale nerozpustné ukládání způsobuje poškození tkání

Chaperony pomáhají získat proteinům 3D strukturu chrání před vznikem patologických konformací Molekulární Rozpoznávají patologický protein, vážou se na hydrofobní povrch a inhibují agregaci. Patří se hlavně tzv. heat shock proteiny (vznikající při tepelném poškození)-chrání před denaturací. Chemické Upravují podmínky uvnitř buněk, stabilizují proteiny proti tepelné a chemické denaturaci (glycerol). 3. Farmakologické Váží se na specifickou konformaci, stabilizují ji. Prevence před proteosomální degradací.

Molekulární chaperony Hsp 70 - nově syntetizované proteiny: Chaperoniny - špatně zavinuté proteiny:

Možnosti terapie PCD Inhibice a opravení konformačních změn Vývoj nových peptidů (β-sheet breakers) Chaperony: důležitá úloha v kontrole zavinování, experimentálně studovány

Amyloid agregovaná proteinová struktura složená z nerozvětvených mikroskopických fibrilů, která se ukládá ve tkáních ve formě deposit a je spojená s různými chorobami pojem amyloid se nevztahuje na určitý protein či sekvenci, ale vyjadřuje typ konformace nejrůznějších proteinů struktura amyloidu je charakterizována přítomností zkřížených struktur β-skládaného listu amyloid je patologická struktura vytvořená v důsledku molekulárního či buněčného stresu z proteinů, které jsou v nativním stavu funkční Nativní konformace proteinů tvořící amyloid je rozličná, struktura amyloidu je tvořena zkříženými strukturami β-skládaného listu.

Amyloidní fibrily β2-microglobulinu Struktura amyloidních fibril rovné, nerozvětvené, velikost 80-160A složeny ze 2 až 6 protofilament (30-40A) bohaté na struktury β-struktury (řetězec β-skládaného listu je kolmý na osu fibrilu, vzájemně jsou spojeny vodíkovými můstky) Amyloidní fibrily β2-microglobulinu

Amyloidní fibrily jsou tvořeny různými proteiny Odlišnosti: velikost, struktura v nativním stavu, buněčná lokalizace, vlastnosti Společný znak: struktura v agregátech (β-struktury) Nízký výskyt prolinu v proteinech tvořících amyloid (prolin se neslučuje s β-strukturou, což je dominantní struktura amyloidních fibril). Amyloid fibrils composed of different proteins share a number of common structural features, despite the fact that these proteins, in their native states, vary widely in structure, cellular localizations, and properties.

Toxicita amyloidních fibril Ukládání velkého množství amyloidu ve tkáních a orgánech vede k poškození funkce (případ systémových amyloidos) Poškození v důsledku relativně malého množství amyloidu (případ neurodegenerativních chorob) 1. Poškození způsobené imunitní reakcí na amyloidní deposita 2. Depolarizace membrán v důsledku poškození amyloidními fibrily 3. Doplňování jiných proteinů do proteinového agregátu a chybění jejich normální funkce 4. Poškození nebo přesycení buněčného aparátu pro odstranění poškozených proteinů (systém ubikvitin-proteasom, chaperony) Amyloid can cause life-threatening disease by accumulating in such high mass that normal tissue sructure and function are disrupted. In the neurodegenerative diseases, the accumulated mass of amyloid is very low compared to the surrounding cell mass. The mechanism by which amyloid fibrils cause cell death is not at all clear. Toxicity mechanisms under investigation include the following: 1. collateral damage caused by immune responses to an amyloid deposits, 2. membrane depolarization resulting from channels created by amyloid fibril assembly intermediates inserted into membranes, 3. recruitment of other proteins into growing aggregates, which has the effect of denying the cell activity of the recruited proetins, 4. disruption of the normal cellular apparatus for breakdown and elimination of misfolded proteins, such as the ubiquitin-proteasome systém and the molecular chaperones.

Polypeptid Postižené orgány Transthyretin Srdce, ledviny, periferní neuropatie Sérový amyloid A Ledviny, periferní neuropatie Lehký řetězec imunoglobulinu Ledviny, srdce Těžký řetězec imunoglobulinu Slezina β2-mikroglobulin Syndrom karpálního tunelu, osteoartropatie Ostrůvkový amyloidový polypeptid Pankreatické ostrůvky Fibrinogen α-řetězec Ledviny Apolipoprotein A1 Periferní neuropatie, játra Atriální natriuretický peptid Srdce Amyloid β (Aβ) Mozek (Alzheimerova choroba, cerebrální amyloidní angiopatie) α-Synuklein Mozek (Parkinsonova choroba) Huntingtin Mozek (Huntingtonova choroba) Prionový protein (PrP) Mozek (Creutzfeldt-Jakobova choroba, BSE) Cystatin C, Gelsolin Mozek (cerebrální amyloidní angiopatie) ABri Mozek (britská familiární demence) Major polypeptide components of pathogenic amyloid deposits in humans. Table lists some of the over 30 human disease states in which amyloid fibrils have been observed, as characterized by the principal organ invilved and the principal protein component of each. Amyloid diseases can occur both in the brain and in the rest of the body. The systemic amyloid diseases tend to involve large deposits of amyloid that in extreme cases dramatically increase the size of the affected organ. The toxicity of the amyloid deposits may be largery due to the mass of deposited material and its ability to disrupt normal tissue structure and function. In some peripheral amyloid diseases, the amyloid deposits are localized to a particular tissue. Amyloid is also observed in a number of brain diseases.

Molekulární faktory tvorby amyloidu Abnormální zavinutí proteinu je klíčové pro tvorbu amyloidu Stabilita proteinu (stálost nativní konformace proti abnormální) je důležitý faktor pro náchylnost k tvorbě amyloidu Destabilizační faktory: 1. Extrémní podmínky prostředí (např. kyselé buněčné kompartmenty) 2. Proteolytické štěpení proteinů (endogenní proteasy) 3. Mutace, které pozmění primární strukturu (mnoho amyloidos má familiární formu způsobenou mutací proteinovém prekursoru amyloidu) Misfolding is central to amyloid formation. Protein stability-the resistance of the folded conformation to misfolding-is an important factor in determining susceptibility to amyloid formation.

Amyloid assembly: Amyloid fibril formation in vitro typically exhibits a lag phase, followed by a rapid growth phase. The lag phase can be abbreviated if a small amount of fibril is provided as seed. Fibril growth takes place by nucleated growth polymerization. Other molecules are involved in amyloid growth in vivo. In vitro, after the nucleation (or seeding) phase has occurred, growth continues predominantly via the elongation of existing fibrils. This is a more realistic view of how amyloid develops in vivo. Amyloid growth from monomeric proteins seems to proceed via the formation of successively large, more complex structures, from small globular aggregates to short curvilinear filaments to isolated straight and unbranched fibrils to bundles of fibrils. The early assembly intermediates in this progression appear to be more cytotoxic that the mature fibrils, leading to the speculation that assembly intermediates are the real culprits in disease pathogenesis.

Přehled nemocí způsobených amyloidem (amyloidosy) Systémové amyloidosy 1. Primární Neznámá příčina, abnormální produkce imunoglobulinů, nerozpustné fibrily ve tkáních a orgánech, poškození jejich funkce Poškozené orgány: jazyk, střevo, svaly, nervy, kůže, ligamenta, srdce, játra, slezina a ledviny 2. Sekundární V důsledku infekce, chronického zánětu, nádoru 3. Familiární Mutace proteinů způsobí jejich agregaci a ukládání ve formě amyloidu (např. transthyretin) Orgánové specifické amyloidosy Diabetes mellitus typ 2 (amylin) Alzheimerova choroba (Aβ) Parkinsonova choroba (α-synuklein) Huntingtonova choroba (huntingtin) Přenosné spongioformní encefalopatie (prion protein) Srdeční amyloidosa (PrP nebo transtyretin) Primary amyloidosis: A disorder in which insoluble protein fibers are deposited in tissues and organs, impairing their function. The cause of primary amyloidosis is unknown, but the condition is related to abnormal production of immunoglobulins by plasma cells (a type of immune cell). Symptoms are related to the organs affected by the deposits, which can include the following: tongue, intestines, skeletal and smooth muscles, nerves, skin, ligaments, heart, liver, spleen, and kidneys. Cardiomyopathy (decreased heart function), renal failure (kidney failure), carpal tunnel syndrome (painful swelling of nerves in the wrist), malabsorption (inadequate absorption of nutrients from the intestinal tract), gastrointestinal reflux, and other conditions can result. The deposits infiltrate the affected organs, causing them to lose resilience and become stiff, which decreases their ability to function. Primary amyloidosis is rare, occurring only in 1 out of 100,000 people. Secundary amyloidosis: Secondary amyloidosis can be caused by infection, inflammatory diseases, and sometimes cancer.

Opakování: Popište termodynamický model skládání proteinu Jak vypadá protein s patologickou konformací? Jakým mechanismem poškozuje organismus? Osud patologického proteinu v buňce. Co jsou to chaperony? Možnosti terapie nemocí způsobených patologickou konformací. Co je to amyloid? Které proteiny tvoří amyloid? Popište model vzniku amyloidních fibril. Proč jsou amyloidní fibrily toxické?

Schémata použitá v prezentaci: Marks´ Basic Medical Biochemistry, A Clinical Approach, third edition, 2009 (M. Lieberman, A.D. Marks) Principles of Biochemistry, Third Edition, 2008 (D.J. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt)