Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA Michal Jurajda ÚPF

Odběr materiálu pro izolaci RNA Problém „biologicko-vědecký“ Problém technologický Problém organizační

Problém „biologicko-vědecký“ Co? Proč? Jak? Kdy?

Získávání materiálu Přímo v laboratoři Ve zdravotnickém zařízení Tkáňové banky a archivy preparátů

Zpracovávaný materiál Buněčné kultury Čerstvá tkáň Tkáň z tkáňových bank z parafinových bločků

Obecné poznámky RNázy jsou stabilní, velice aktivní a nevyžadují kofaktory Obecně potřeba pracovat v čistším prostředí než při izolaci DNA

Požadavky na odběr Uchování co největšího množství RNA – snaha uchovat intaktní bb. až do lýzy ve speciálním pufru. Uchování expresního profilu – okamžité usmrcení bb. a stabilizace RNA.

Postup práce Odběr, transport, stabilizace Odběr,stabilizace, transport Lýza Homogenizace Izolace RNA Stabilizace (-80 nebo liqN2) Reverzní transkripce + real-time PCR

Postup práce Postupné zpracovávání Dávkové zpracování

Technologie odběru Transport in vivo Okamžitá izolace RNA

Technologie odběru Odběr ve zdravotnickém zařízení Stabilizace vzorku Kultivační medium + okamžitý transport Snap-frozen, N2, ultralow freezer RNAlater PAXgene

Technologie izolace Příprava vzorku Lýza buněk Homogenizace Zamražené nerozpouštět Lýza buněk Lytické pufry obsahují inhibitory RNáz Homogenizace Mechanické rozbití makromolekul Izolace RNA „no proteins = no RNA-ses“

Praktická realizace Fázová separace Selektivní vazba Centrifugace Vývěvy Manuální systémy Automatické systémy

Kritické kroky Stabilizace kvantity i kvality RNA v tkáňovém vzorku Uchování izolované RNA Uchování cDNA ????

Organizační problémy Specializovaní pracovníci popřípadě zaškolení stávajících pracovníků Přístrojové vybavení (low freezer, N2) Evidence vzorků a rychlá komunikace

Řešení ?

Řešení AMBION QIAGEN MRC Appliedbiosystems RNAlater, RNAwiz, ToTALLY RNA QIAGEN PAXgene System, RNAeasy MRC TRI reagent Appliedbiosystems Total RNA Isolation Chemistry, ABI 6100

Řešení AMBION RNAlater 500ml 310€ ToTALLY RNA 100ml (pro 10g tkáně) 276€ + plastik RNAwiz 100ml 144€ + plastik + chloroform + isopropanol

Řešení QIAGEN PAXgene System (Tubes+Kit) 100 izolací 25 000Kč + 2x 12 900 Kč RNAeasy mini kit 250 izolací 29 000Kč

Řešení MRC TRI reagent 500ml 50g tkáně/166ml krve 418$/455$ + plastik

Co? Proč? Jak? Kdy?