Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně

Prezentace na téma: "Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně"— Transkript prezentace:

1 Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně
Autor - Jana HRONOVÁ, spoluautoři: Alena Hnátková, Petra Koutová Patologicko-anatomické oddělení Karlovarské krajské nemocnice a. s.

2 1. Schéma stavby kosti

3 2. Histologická stavba kosti
Specializovaná pojivová tkáň složená ze zvápenatělé mezibuněčné hmoty – kostní matrix a tří různých typů buněk (osteocytů, osteoblastů a osteoklastů). Kostní matrix je tvořena převážně vápníkem a fosforem tvořícími krystalky hydroxyapatitu. Organická hmota je tvořena kolagenem typu I a amorfní základní hmotou. Spojení hydroxyapatitu s kolagenními fibrilami zajišťuje kosti charakteristickou tvrdost a pružnost.

4 3. Princip odvápňování kostní tkáně
K odvápnění tvrdých tkání byla vypracována řada metodik, založených na rozpuštění minerální komponenty nejčastěji účinky slabých roztoků kyselin, např. kyseliny dusičné, kyseliny mravenčí, chelatonu…

5 4. Zpracování kosti před odvápňováním
Zhodnocení velikosti vzorku (větší kost nařezat na lamely cca 5 mm). Dostatečná fixace ve fixační tekutině (např. formol hod.) Vypírání v tekoucí vodě po dobu 1 hod.

6 5. Postup při odvápňování kosti
Tkáň musí být fixovaná, doba fixace hod. Při nedostatečné fixaci hrozí poškození tkáně. Po fixaci musí být z tkáně odstraněna fixační tekutina vypíráním v 70% etanolu nebo tekoucí vodovodní vodě po dobu 1 hod. Odvápnění musí být rychlé. Doba odvápnění se řídí podle velikosti tkáňového bločku, druhu dekalcifikační tekutiny. Doba trvání několik dnů. Po skončení odvápňování musí být dokonale odstraněna dekalcifikační tekutina vypráním v některé ze solí (kamenec sodný, borax).

7 6. Odvápnění 10% kyselinou dusičnou
vypírání fix.tekutiny v tekoucí vodě………..1 hod. 10% kyselina dusičná……………….do odvápnění neutralizace - 5% roztok síranu sodného….…1 hod. vypírání v tekoucí vodě………………………1 hod. dále – odvodnění od 70% etanolu ……… (jako při zpracování běžného parafinového bločku)

8 7. Odvápnění kyselinou mravenčí
vypírání fix.tekutiny v tekoucí vodě……...1 hod. 2,5% kyselina mravenčí.………….do odvápnění (- vždy po 48 hod. vyměnit!) neutralizace 3% roztokem boraxu……….24 hod. vypírání v tekoucí vodě…………………….1 hod. dále - odvodnění od 70% etanolu … (jako při zhotovování běžného parafinového bločku)

9 8. Zalévání tkáně do parafínu pomocí tkáňového procesoru
ODVODNĚNÍ – 70 % etanol, 80 % etanol, 96 % etanol, aceton-xylen (1:1)………4 hod. PROSYCENÍ INTERMÉDIEM – xylen……………..……..1 hod. PROSYCENÍ ZALÉVACÍM MÉDIEM – parafín……..5 hod. VLASTNÍ ZALITÍ – přefiltrovaný parafín zahřátý na teplotu 56°C.

10 9. Krájení parafinového bloku na sáňkovém mikrotomu

11 10. Barvení histologického preparátu
ODPARAFÍNOVÁNÍ – xylen, xylen, 96% etanol, 80% etanol, 70% etanol, dest.voda BARVENÍ – vybranou technikou OPLACH – dest.vodou ODVODNĚNÍ - 96% etanol (2 lázně), aceton, aceton-xylen (1:1) PROJASNĚNÍ – xylen (2 lázně) ZAMONTOVÁNÍ – překrytí preparátu krycím sklíčkem

12 11. Mikrofotografie preparátu odvápněného kys. dusičnou

13 12. Mikrofotografie preparátu odvápněného kys. mravenčí

14 13. Výsledné zhodnocení: kyselina dusičná x kyselina mravenčí
Odvápnění je rychlejší (1 - 4 dny) Odvápnění zhoršuje barvitelnost preparátů – obzvláště jader bb Odvápnění je výrazně pomalejší (u tvrdého materiálu minimálně týden – 14 dní) Odvápnění nemá vliv na barvitelnost jader a buněčných struktur

15 14. Použitá literatura Obecná a speciální histologie – Karel Dvořák
Histologie a histologická technika – Zdeněk Vacek Základy histologie – L. Carlos Junqueira, José Carneiro, Robert O. Kelley

16 Děkujeme za pozornost