Mikrobiologická kontrola v pivovaru se zaměřením na pivu škodící mikroorganizmy Dagmar Matoulková, Jana Kopecká Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s. Zvíkovské Podhradí, 20.3.2015

Obsah prezentace Pivo – rizika mikrobiální kontaminace Zdroje mikrobiální kontaminace Mikroorganizmy a biofilm Mikrobiální kontaminace v pivovaru Příklady mikrobiálního poškození piva – DEGU 

1. Pivo – rizika mikrobiální kontaminace Hlavní faktory ovlivňující mikrobiologickou stabilitu piva: - Koncentrace rozpuštěného kyslíku - Obsah alkoholu - Hořké chmelové látky - Nízký obsah živin - Nízké pH Mikroorganizmy schopné kazit pivo: bakterie mléčného kvašení, divoké kvasinky Kontaminace během výroby – kvasnice, mladina – produkty metabolizmu mikrobů přecházejí nevratně dál a poškodí senzorický profil piva (diacetyl, kyselina máselná, DMS atd.).

2. Zdroje mikrobiální kontaminace Zdroje kontaminace v prostředí pivovaru: Vzduch, voda Hmyz (octomilky, vosy, mouchy) Vnější prostředí (prostřednictvím obuvi, předmětů přinášených z venku) Zbytky jídla, potraviny skladované v pivovaru Zařízení pivovaru, nevhodně umístěná kanalizace → opakovaná kontaminace Špinavé lahve, kegy, nádoby, hadice .... → opakovaná kontaminace Kontaminované kvasnice → opakovaná kontaminace Kvalita hotového piva je z velké části ovlivněna hygienickým stavem výroby. Vedle účinného čištění a sanitace je důležitá osobní hygiena.

Osobní hygiena Stálá mikroflóra pokožky rukou: - vyskytuje se na povrchu i ve vnitřních vrstvách kůže, v okolí nehtů; - má konstantní složení, nelze ji odstranit mechanicky (za 6 minut pečlivého mytí se odmyje pouze asi 60 % rezidentní mikroflóry), odstranit lze jen dezinfekcí stafylokoky, sarciny, korynebaktéria, mikrokoky, viry Přechodná mikroflóra pokožky rukou: množství a poměr mikroorganismů je dán kontaktem člověka s prostředím - přežívá omezenou dobu, někdy i několik hodin, lze ji odstranit dezinfekcí rukou, streptokoky, enterokoky, octové bakterie, E. coli, Pseudomonas, kvasinky, viry.

Otisky prstů 

Hmyz Mouchy, vosy, sršně, octomilky jsou zdrojem mikroorganizmů, zejména kvasinek. živí se potravou bohatou na cukr (ovoce, šťávy, komposty), s potravou požírají i různé druhy kvasinek a jiných mikrobů. Střeva některých druhů hmyzu slouží jako zimoviště kvasinek a tyto druhy umožňují kvasinkám šířit se do různých prostředí.

Rozvoj kontaminace závisí na různých faktorech - množství živin (= cukry sladiny, mladiny), - technologické prodlevy (např. zchlazená nezakvašená mladina), - špatná hygienická úroveň pivovaru – vrstvy nečistot, biofilm – chrání mikroby proti účinkům dezinfekčních látek (při čištění nedochází ke kompletnímu průniku chemikálií k mikrobům), - při nevhodném způsobu odstraňování nečistot a např. i biofilmu (např. ostřikem hadicí) může docházet k tvorbě aerosolu a k ještě větší kontaminaci provozu, - teplota je důležitý faktor prostředí 20–30°C

3. Mikroorganizmy a biofilm Biofilm = mikrobiální společenství vytvářející tenkou vrstvu na pevném povrchu (potrubí, stěna kádě, zub, kámen v potoce atd.) - na povrch se buňky přichytí pomocí vhodných molekul, které samy produkují (bílkoviny, glykopeptidy, polysacharidy) a posléze začnou tvořit polysacharidy - z nich vzniká "hlenový základ", který drží buňky pohromadě a vytváří lešení, v němž se buňky množí - prostředí pivovaru je extrémně bohaté na živiny a jeho povrchy jsou náchylné k tvorbě biofilmů - biofilmy jsou zdrojem opakované kontaminace zařízení - koncentrace kyslíku na povrchu biofilmu je nízká, o trochu hlouběji stoupá a dále do hloubky podle očekávání klesá, takže v základní vrstvě je nulová. → společná existence mikroorganizmů aerobních (potřebujících kyslík) a anaerobních (žijících bez kyslíku)

Zdroj opakované kontaminace

- buňky v biofilmu jsou odolné k antimikrobiálním látkám a dezinfekčním prostředkům - při čištění nedochází ke kompletnímu průniku chemikálií do biofilmu – sanitace bez předchozího mechanického odstranění biofilmů je neúčinná! Faktory vzniku biofilmu: přítomnost mikroorganismů (přítomny vždy) přítomnost živin (sladina, mladina, kvasnice, pivo) vhodný povrch (různé materiály, ZEJMÉNA NARUŠENÝ POVRCH) vhodná teplota (čím vyšší teplota, tím rychlejší tvorba biofilmu) dostatek času (hodiny až dny) nedostatečné mechanické odstranění biofilmu základní množství mikrobů přežívajících sanitaci (čím více mikrobů na počátku, tím rychlejší tvorba biofilmu)

SANITACE = čištění + desinfekce Čištění = odstranění nečistot z povrchů SANITACE = čištění + desinfekce Dezinfekce = odstranění mikroorganismů, většinou vodnými sanitačními prostředky Detergent Desinfekční prostředek Mikrob

4. Mikrobiální kontaminace v pivovaru Fáze výroby Druh kontaminace Zdroj kontaminace Škodlivost Kvasnice divoké kvasinky, mléčné bakterie (pediokoky), enterobakterie předchozí provoz (keg), kont. mladina zpomalení kvašení, nežádoucí senzorické látky (DMS, diacetyl...) Spilka divoké kvasinky kont. násadní kvasnice, vzduch, nádoby zpomalení kvašení, super-atenuace, vznik fenolických látek mléčné bakterie (pediokoky) kont. kvasnice, nádoby tvorba diacetylu, kyseliny mléčné enterobakterie kont. kvasnice, nádoby (voda) zpomalení kvašení, tvorba DMS... Sklep mléčné bakterie (pediokoky, laktobacily) předchozí fáze, nádoby tvorba diacetylu, kyseliny mléčné, super-atenuace

Mléčné bakterie produkce nežádoucích senzorických látek: kyselina mléčná, k. octová, diacetyl – poškození piva → kyselá, octová, máslová chuť piva super-atenuace – hlubší prokvašení piva, za současné produkce organických kyselin (některé laktobacily mají schopnost zkvašovat dextriny) Lactobacillus brevis, L. lindneri, L. plantarum, L. casei, Pedicococcus damnosus, P. inopinatus Kontaminovaná piva: MLÉČNÁ OCTOVÁ DIACETYL

Enterobakterie nemnoží se v hotovém pivu, nekazí ho (alkohol, pH) inhibují aktivitu pivovarských kvasinek, soupeří s nimi o substrát – bakterie jsou menší, rychleji se množí mohou kontaminovat mladinu / kvasnice a produkovat látky udělující pivu ovocné a zeleninové aroma (DMS, organické kyseliny) – nevratné poškození piva Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia Kontaminovaná piva: DIMETHYLSULFID

Divoké kvasinky produkce nežádoucích senzorických látek: fenolické látky, kyselina octová, etylacetát atd. – nevratné poškození piva super-atenuace – hlubší prokvašení piva, abnormálně vysoký obsah alkoholu soupeření s pivovarskými kvasinkami (jednodušší metabolizmus) vizuální poškození piva - zákal / křís/ sediment zdroj kontaminace – prostředí, suroviny, kvasnice Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus, Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Dekkera, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Torulaspora, Zygosaccharomyces Kontaminovaná piva: 4-VINYL GUAJAKOL ETHYLACETÁT

Látky produkované kvasinkami během kvašení mladiny: etanol, vyšší alkoholy, glycerol vicinální diketony (diacetyl, pentandion) estery organické kyseliny CO2, sirné látky Množství a poměr látek produkovaných kvasinkami během kvašení mladiny je do jisté míry ovlivněno kmenem kvasinek, podmínkami kvašení (složení mladiny, teplota, zákvasná dávka, množství kyslíku na začátku kvašení, délka kvašení a ležení atd.) a přítomností mikrobiální kontaminace (divoké kvasinky, bakterie; infikované kvasnice)

Vyšší alkoholy (50-150 mg/l) – vedlejší produkty metabolizmu aminokyselin; svrchně kvasící kmeny produkují více vyšších alkoholů. - propanol, 2-metylpropanol, 2- a 3-metylbutanol, 2-fenyletanol Estery (20-100 mg/l) – vznikají reakcemi alkoholů a mastných kyselin. Udělují pivu aroma; u svrchně kvasících kmenů vyšší produkce esterů - etylacetát, izoamylacetát, izobutylacetát Aldehydy (10-50 mg/l) – tvořeny na začátku kvašení, později jsou kvasinkami odbourávány. - acetaldehyd Vicinální diketony – vznikají při syntéze aminokyselin, nadbytek diacetylu způsobuje máslovou chuť a vůni piva. VDK vznikají spontánně, později během kvašení jsou kvasinkami enzymaticky odbourávány - diacetyl, pentandion Sloučeniny síry - produkty metabolizmu aminokyselin H2S, DMS, SO2, merkaptany (tioly) – ve velmi nízkých koncentracích Organické kyseliny – ovlivňují pH a aroma piva - mléčná, jablečná, citronová, octová, propionová, máselná, kaprylová atd.

Příklady mikrobiálního poškození piva Název chuti/vůně Význam Původ/příčina LAK NA NEHTY etyl-acetát Vyskytuje se ve všech pivech. Hraje důležitou roli v celkové vyváženosti chuti. Ve vysokých koncentracích cizí příchuť. Produkují ho kvasinky během kvašení. Rovněž ji produkují některé divoké kvasinky. HŘEBÍČKOVÁ 4-vinyl guajakol Obvykle se jedná o cizí příchuť. Má hlavní vliv na chuť některých výrobků, např. pšeničných piv. Vzniká činností divokých kvasinek nebo speciálních kvasinek. ZVRATKY k. máselná Cizí příchuť v pivu. Tuto chuť tvoří mladinové bakterie. Příležitostně vzniká při škodlivé bakteriální činnosti ve stočeném pivu. MÁSLOVÁ diacetyl Obvykle se jedná o cizí příchuť. Pozitivně přispívá k chuti některých typů piv. Tvoří se z prekurzoru vytvořeného kvasinkami při kvašení. Také ji mohou tvořit kontaminující bakterie. VAŘENÁ ZELENINA DMS Žádoucí charakteristický rys některých druhů světlých ležáků. U některých jiných piv se jedná o cizí příchuť. Tvoří se při výrobě mladiny z prekurzoru pocházejícího ze sladu. Kontaminující bakterie během kvašení. OCTOVÁ k. octová Nachází se ve všech pivech. Ve vysokých koncentracích se jedná o cizí příchuť. Tuto chuť produkují kvasinky při kvašení a kontaminující octové bakterie a divoké kvasinky. MLÉČNÁ k. mléčná Významně přispívá ke kyselosti (aciditě) piva a k vyváženosti chuti. Ve vysokých konc. cizí příchuť. Tuto chuť tvoří bakterie při rmutování. Rovněž ji tvoří kontaminující bakterie při kvašení, ležení a ve stočeném pivu.

Děkuji za pozornost ....  Připravujeme .............. Otočné schéma nežádoucích chutí a vůní piva způsobených mikrobiální činností – s uvedením příčin a řešení problémů

A příště uvidíte uslyšíte .......