Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Neinvazivní prenatální diagnostika na základě fetálních nukleových kyselin přítomných v mateřské cirkulaci Metodika Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3. LF UK

Odběr krve Krev odebrána do zkumavek EDTA EDTA = kyselina ethylendiaminotetraoctová Při odběru krve vyvazuje vápník → nesrážlivá krev (působí podobně jako citrát) Vyvazování některých dvojmocných kationtů - lék při otravě olovem, rtutí K vyšetření pro účely NIPD obvykle potřeba 11 ml

Plazma vs sérum pro účely NIPD Proces zpracování krve klíčové, využívána plazma Množství fetální DNA v plazmě a séru je srovnatelné Ve srážlivé krvi dochází při koagulaci k destrukci mateřských buněk a uvolnění mateřské DNA → až 15x zvýšené množství → snížení senzitivity analýzy Lo et al., 1998

Žádanka na vyšetření

Informovaný souhlas

Separace plazmy z nesrážlivé PK Klíčové – při použití větší odstředivé síly klesá množství celkové DNA a dle některých studií i množství fetální DNA Centrifugace 2x při 1200g Zpracování do 24h odstředivá síla [g], kolikrát se při odstřeďování znásobí hmotnost částic ↑ poloměru rotoru a rychlosti → ↑g

Izolace DNA z plazmy QIAamp DSP Virus kit (Qiagen) komerční kit, CE-marked Určeno pro izolaci virových NK (DNA + RNA) z lidské plazmy nebo séra cffDNA je fragmentována (apoptotický trofoblast), hlavní podíl fragmenty 100-300bp a 300-500bp Využívá selektivní vazebné vlastnosti membrán na bázi křemíku Vakuový systém, manuálně Modifikovaný protokol

Izolace DNA z plazmy – 4 fáze Metoda QIAamp DSP Virus zahrnuje 4 kroky: Lýza vzorku (AL pufr, proteáza, inaktivace RNáz, při 56°C) Adsorbce NK na silikagelovou membránu při průchodu lyzátu díky podtlaku Promytí membrány Eluce virových nukleových kyselin z membrány (60 μl AE pufru)

PCR Reakční směs: dNTPs, PCR pufr s Mg2+, polymeráza, primery, voda

PCR http://www.onkologickecentrum.cz/downloads/vysetreni/laborator-metody.pdf

Konvenční PCR DNA/RNA izolace DNA amplifikace Elektroforéza (pokud izolace RNA, 1. krok je RT PCR) Elektroforéza

Nevýhody konvenční PCR pro NIPD Nízká senzitivita a specificita – zásadní pro NIPD Nízké rozlišení Pracné, bez automatizace, práce s ethidium bromidem, nutná speciální místnost Analýza až výsledného produktu amplifikace na elektroforéze → daná sekvence je/není přítomna ALE velmi orientační kvantifikace → PCR v reálném čase

Určení pohlaví plodu neinvazivně - senzitivita a specificita různých PCR metod

RHD genotypizace plodu neinvazivně- využití real-time PCR

Real-time PCR Založena na principu klasické PCR Umožňuje kvantifikaci sledovaného úseku DNA - záznam každého PCR cyklu ve skutečném čase Pro záznam amplifikace se využívají sondy (fluorescenční látky), které se váží specificky nebo nespecificky na amplifikovanou DNA Ct = 1. signifikantní zvýšení PCR produktu (zaznamenáno pomocí zvýšení fluorescenčního záření, koreluje s iniciálním množstvím sledované sekvence Fluorescence PCR cyklus

Fluorescenční sondy Specifická vazba mezi sondou a cílovou sekvencí: TaqMan sondy, MGB sondy, Scorpion, Molecular beacons Nespecifická vazba: SYBR Green Riziko falešně pozitivních signálů při nespecifických vazbách, nevhodné pro NIPD

www.appliedbiosystems.com

Kvantifikace NK pomocí real-time PCR Vytvoření standardní křivky DNA o známé koncentraci (měříme na spektrofotometru)

Kvantifikace NK pomocí real-time PCR 6,6 pg DNA/diploidní buňka Příklad: 42 ng/μl = 42 000 pg/μl : 6,6 = 6363 kp/μl Spočítáme si, kolik kp/1 PCR jamka Minimálně 3 koncentrace, obvykle desítkové ředění Využití v NIPD: kvantifikace NK (SRY, GLO, RASSF1A) u gravidit s patologickou placentací (PEP, IUGR)

Určení pohlaví plodu neinvazivně (ČR) Od 10. týdne U gravidit v riziku výskytu X-vázaných chorob nebo CAH (od 6. týdne, kvůli zahájení terapie) Konvenční PCR nedosáhla 100% senzitivity a specificity → PCR v reálném čase

Určení pohlaví plodu neinvazivně (ČR) Amplifikace paternálních alel pomocí real-time PCR SRY gen (sex determining region) -1 kopie DYS 14 gen (TSPY1- testis specific protein) – variabilní počet kopií 100% senzitivita a 100% specificita u detekce SRY genu

Určení pohlaví plodu neinvazivně (ČR) X–vázaná onemocnění - plody ženského pohlaví (SRY a DYS14 negativní), není nutná CVS a/nebo AMC, pozdější konfirmace UZ CAH – plody mužského pohlaví (SRY a DYS14 pozitivní), možnost vysadit terapii (dexamethason) Dexamethason - zabraňuje virilizaci zevního ženského genitálu, nutné podávat od 5.-9. týdne

Kazuistika – pacientka č. 2270 Pacientka v 10. týdnu gravidity Děti: chlapec, 6 let, CAH Nyní suspektní CAH u plodu GLO Testování na SRY, GLO systém SRY: 6/6+, je to chlapec GLO: izolace je OK Možnost vysadit Dexamethason SRY

Kazuistika – pacientka č. 2290 Pacientka: přenašečka hemofilie A Týden gravidity 11+5 GLO Testování na SRY, GLO systém SRY: 0/6+, je to děvče GLO: izolace je OK Pacientka nemusí podstoupit další vyšetření (AMC)

Určení RHD faktoru u plodu neinvazivně U anti-D aloimunizovaných těhotenství v riziku fetální erytroblastózy nebo hemolytického onemocnění novorozence Od 10. týdne gravidity RhD negativita – 15% kavkazské populace Delece genu Alterace RHD genu (pseudogen RhD ψ, RHD-CE-D fúzní gen)- zamezí expresi kódovaného proteinu – pozor na falešně poz. výsledky u RHD fenotypicky neg. jedinců

RhD negativita u ostatních etnik RHD (pseudogen) Inaktivní kompletní RHD gen, 37-bp inzerce exon 4 (PCR) + 1-2 předčasné stop kodony v exonu 6, předčasná terminace translace, 0 HON 66% černošské populace , 27,7% Japonců a11% Brazilců Hybridní RHD-CE-D gen RhD negativní fenotyp: 3´ konec exonu 3 a exony 4-8 RHCE genu, RHD exon 10 +, exon 7 – (PCR) Weak C, VS+, Afričané (3%)

RHD u anti-D aloimunizovaných těhotenství v riziku fetální erytroblastózy a HON Pro spolehlivou RHD genotypizaci – nutné analyzovat více oblastí RHD genu Nejčastěji kombinace exonu 7 a 10 nebo exonu 7 a 5 Nutné zohlednit etnickou populaci (výskyt alterací RHD genu)

RHD u anti-D aloimunizovaných těhotenství v riziku fetální erytroblastózy a HON (ČR) U nás - kombinace exonu 7 a 10 100 % specificita a 100 % senzitivita u detekce RHD exon 7 a exon 10 RhD negativní plody u aloimunizovaných těhotenství nejsou ohroženy HON, u pozitivních plodů včasná informace pro klinika

Kazuistika – pacientka č. 2283 Pacientka RhD negativní Týden gravidity 20+6 Anti-D protilátky v mateřském séru, titr 1:32+ Testování na RHD exon 7 a 10, GLO systém RHD exon 7: 3/3+ RHD exon 10: 3/3 + GLO: izolace je OK Plod je RhD pozitivní, nutné dále pravidelně sledovat Je ohrožen fetální erytroblastózou a HON GLO RhD exon 7 RhD exon 10

Kazuistika – pacientka č. 2212 Pacientka RhD negativní Týden gravidity 20+6 Anti-D protilátky, titr 1:8+ Testování na RHD exon 7 a 10, GLO systém RHD exon 7: 0/3+ RHD exon 10: 0/3 + GLO: izolace je OK Plod je RhD negativní Není ohrožen fetální erytroblastózou a HON GLO

RHCE genotypizace plodu neinvazivně Fetální erytroblastóza a HON –může být způsobena také dalšími antigeny Rh systému → RHCE genotypizace plodu u anti-c, anti-E a anti-C aloimunizovaných těhotenství

RHCE genotypizace plodu Amplifikace paternálních alel pomocí real-time PCR C/c a E/e polymorfismus - nukleotidové substitucemi a inzerce v RHCE genu Ser103Pro polymorfismus (SNP v exonu 2) pro Rhc Pro226Ala polymorfismus (SNP v exonu 5) pro RhE 109 bp inzerce v intronu 2 pro RhC

RHCE genotypizace plodu exon 2 (Rhc) intron 2 (RhC) exon 5 (RhE/Rhe)

RHCE genotypizace plodu (ČR) 100 % specificita a 100 % senzitivita u detekce RHD exon 7 a exon 10, RHCE (C alela) 100 % specificita a 95 % senzitivita u RHCE (c alela a E alela) genotypizace (SNP), někdy problém - většina DNA je mateřského původu RhcCE negativní plody u aloimunizovaných těhotenství nejsou ohroženy HON, u pozitivních plodů včasná informace pro klinika

Kazuistika – pacientka č. 2283 Pacientka RhE negativní (ee fenotyp) Týden gravidity 20+6 Anti-E protilátky, titr 1:16+ RHE: 6/6+ GLO: izolace je OK Plod je RhE pozitivní, nutné dále pravidelně sledovat Ohrožení fetální erytroblastózou a HON GLO RHE