Laboratoř potravinářské mikrobiologie (Rokoska) Ústav 320 Lucie Vondráková prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc. doc. RNDr. Jarmila Pazlarová, CSc.
Úvodem … Termotolerantní Campylobacter spp. G- tyčinky Mikroaerofilní atmosféra Optimální teplota 42 °C Onemocnění Akutní střevní infekce tzv. kampylobakterióza C. jejuni (80-85 %) C. coli C. lari Infekční dávka velmi nízká Závažné postinfekční komplikace www.photoshelter.com
Detekce, identifikace a kvantifikace termotolerantních Campylobacter spp. ČSN EN ISO 10272–1 Mikrobiologie potravin a krmiv - horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Campylobacter spp. Selektivní pomnožení Problém rozlišení mezi jednotlivými druhy Nízká biochemická aktivita kampylobakterů Rostoucí počty rezistentních kmenů Časová náročnost
Multiplex qPCR detekce, druhová identifikace primery cílené na druhově specifické geny C. jejuni – hipO (hipurikasa) C. coli – glyA (serin hydroxymethyltransferasa) C. lari – pepT (peptidasa T) absolutní kvantifikace a možnost provedení v multiplexu vynechání pomnožovacího kroku zjištění počtu porovnáním se standardními křivkami triplex – duálně značené hydrolyzační sondy
Návrh protokolu qPCR a výsledky In silico analýza FastPCR nBLAST výběr, chemické modifikace, nastavení experimentu Experimentální postup klasická PCR s elektroforetickým vyhodnocením singleplex/multiplex real-time PCR se SYBR Green křivka tání s cílovými i dalšími druhy kampylobakterů
Analýza křivky tání C. lari C. coli C. jejuni
Návrh protokolu qPCR a výsledky singleplex qPCR multiplex qPCR DNA vzorek jednoho druhu/směsný vzorek DNA validace protokolu na reálných vzorcích - oplachy kuřecích křídel - umělá kontaminace v rozsahu 101-105 CFU/ml - porovnání s klasickou metodou počítání CFU na miskách - kvantifikace pomocí qPCR možná i u nejvyššího ředění - misky – C. jejuni při nejvyšším ředění 100 % negativní, C. coli 33 % a C. lari 67 %
Závěrem Analýza dat a satistika Druh Efektivita (%) LOD (CFU/rce) R2 Slope C. jejuni 90.85 6.62 < LOD < 16.10 0.998 -3.565 C. coli 96.97 5.13 < LOD < 6.30 -3.399 C. lari 92.89 4.87 < LOD < 5.23 -3.506 Analýza dat a satistika 7500 Software (Applied Biosystems, USA, verze 2.0.5) GenEx software (MultiD Analyses AB, Sweden, verze GenEx 5 Enterprise) MIQE guidelines
Děkuji za pozornost