SPECIÁLNÍ METODY PŘI ZPRACOVÁNÍ A BARVENÍ TVRDÝCH TKÁNÍ Nezhybová E., Kašpárková E., Machalová B., Wagner F. Ústav histologie a embryologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci

Úvod tvrdé tkáně představují pro běžná histologická vyšetření komplikaci s ohledem na nutnost demineralizace tkáně k tomuto účelu slouží zředěné kyseliny, které přeměňují nerozpustné soli v soli rozpustné ve vodě k zachování struktury a použitelnosti tkáně je nutné přesně dodržovat správné postupy

Cíle práce cílem naší práce bylo srovnat některé demineralizační postupy, poskytnout přehled speciálních barvení využitelných pro tvrdé tkáně a stanovit možnosti imunohistochemických vyšetření na tvrdých tkáních, které byly demineralizovány

Materiál a metodika jako materiálu jsme použili dospělých lidských zubů a kostí k dekalcifikaci jsme používali: elektrolytické odvápňování chelaton III Löwyho roztok jako barvících postupů jsme používali H.E., Schmorlovu reakci, azan, zelený trichrom, PAS a Saturnovou červeň dále jsme prováděli imunohistochemické reakce

Dekalcifikace (1) doba se řídí velikostí bločku a typem dekalcifikační tekutiny stupeň odvápnění určujeme vbodnutím jehly nebo chemicky /k 5 ml dekalcifikační tekutiny slité z odvápňované tkáně se přidá 5 ml 5% roztoku hydroxidu amonného a 5 ml 5% roztoku šťavelanu vápenatého/

Základní pravidla demineralizace tkáň musí být dobře fixována, jinak dochází k poškození tkáně (bobtnání) důkladné vyprání tkáně po fixaci ve vodě nebo etanolu odvápnění musí být rychlé /dostatečné množství dekalcifikační tekutiny, pravidelné vyměňování/ po odvápnění nutné dokonale vyprat tkáň od dekalcifikační tekutiny /nikdy nesmí ovšem přijít tkáň z dekalcifikačního roztoku do vody/

Dekalcifikace (2) elektrolytické odvápnění chelaton III Löwyho roztok kyselina mravenčí, kyselina chlorovodíková, destilovaná voda chelaton III kyselina etylendiamintetraoctová (EDTA) Löwyho roztok 40% formaldehyd, chlorid rtuťnatý, ledová kyselina octová, destilovaná voda

Barvení tkáně hematoxylin – eosin (HE) Schmorlova reakce Saturnová červeň zelený trichrom azan PAS

Imunohistochemie substrát (DAB) Nepřímá třístupňová imunohistochemická reakce, při které jsme použili primární protilátky proti kolagenu a Ab-1 (na makrofágy) SA-P II. protilátka I. protilátka buněčný antigen

Výsledky - dekalcifikace nejkratší dobu trvání má dekalcifikace v Löwyho roztoku (cca 20 hodin), který je současně fixační tekutinou a výsledná barvení neovlivňuje, současně je vhodný i pro imunohistochemické zpracování tvrdé tkáně elektrolytické odvápnění je rovněž účinné, trvá několik dní a není k tvrdé tkáni příliš šetrné EDTA trvá několik měsíců, ale je nejšetrnější, dosáhnout zkrácení doby odvápnění lze přidáním 2% kyseliny mravenčí, poté je nutné tkáň vyprat v 5% roztoku formaldehydu

Zub – hematoxylin/eosin

Zub – Schmorlova reakce

Zub - azan

Zub – Goldnerův zelený trichrom

Zub - PAS

Zub – Saturnová červeň

Zub – ukázka imunohistochemie

Závěry (1) použití různých typů dekalcifikačních tekutin ovlivňuje délku demineralizace Löwyho tekutina usnadňuje postup, protože je současně i tekutinou fixační, jde o postup z hlediska odvápnění nejkratší a dostatečně šetrný chelaton III (EDTA) je postup dlouhý a pro rutinní laboratoř nevhodný

Závěry (2) při barvení tvrdých tkání lze použít různých speciálních postupů, které poskytují specifické výsledky a umožňují zobrazit potřebné jednotlivé struktury při šetrné dekalcifikaci lze na odvápněné tkáni úspěšně provádět imunohistochemická vyšetření, je ale třeba zvolit vhodný dekalcifikační prostředek

Děkujeme za pozornost 