FYTOPATOLOGICKÝ VÝZKUM NA UP V OLOMOUCI Prof. Ing. Aleš Lebeda, DrSc. Doc. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Šlechtitelů 11, Olomouc - Holice Tř. Svobody 26, Olomouc

Pracovní kolektivy participující na fytopatologickém výzkumu na UP Olomouc Katedra botaniky Prof. Ing. Aleš Lebeda, DrSc. Katedra biochemie Doc. RNDr. Lenka Luhová,CSc. Katedra buněčné biologie a genetiky Doc. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Katedra experimentální fyziky - Laboratoř biofyziky Prof. RNDr. Jan Nauš, CSc.

Řešené projekty: Variabilita složek a interakcí v rostlinném patosystému a vliv faktorů prostředí na jejich projev (MSM6198959215 ) (2005-2011) Diagnostika a metody integrované ochrany proti karanténním a dalším ekonomicky významným patogenům plodové a listové zeleniny MZe ČR (NAZV) QH 71229 (2007 - 2011) Inovace metod ochrany slunečnice MZe ČR (NAZV) QH 71254 (2007 - 2011) Leafy vegetables germplasm, stimulating use EU, AGRI GEN RES 2005 (2006 - 2010) Alternativní přístupy ve využití biotechnologií pro zvyšování rezistence vybraných luskovin k houbovým patogenům MZe ČR (NAZV) QD 60099 (2006 - 2009)

Detekce prokaryotických patogenů révy vinné a specifikace podmínek pro patogenezi jako předpoklad pro jejich účinnou regulaci (NAZV QH71248, 2007-2011). PSYLLID VECTORS - Vývoj kontrolních strategií proti merám vektorům fytoplazem ovocných dřevin v Evropě (EUREKA (MŠMT) OE 180, 2005-2008). (spolunavrhovatel, řešitel ČR části) Epidemiologie stolburu (GAČR 522/06/0618, 2006-2008). Výzkum a inovace postupů diagnostiky hospodářsky významných, regulovaných a karanténních fytopatogenních organismů pro systém certifikace ovocných dřevin s důrazem na molekulární metody (NAZV 60123, 2006-2009). Biodiverzita fytopatogenů: molekulární variabilita a epidemiologie, potyvirů, Flexiviridae a fytoplazem (MŠMT - Barrande, 2007-2008)

STUDOVANÉ SYSTÉMY Onion yellow dwarf virus (OYDV, virus žluté zakrslosti cibule) Pea seed borne mosaic virus (PSbMV, virus mozaiky hrachu přenosné semenem) Plum pox virus (PPV, virus šarky švestky) Candidatus Phytoplasma prunorum (ESFY, fytoplazma Evropské žloutenky peckovin) Candidatus Phytoplasma solani (Stolbur, fytoplazma stolburu) Peronosporales: Bremia lactucae – Lactuca spp. Pseudoperonospora cubensis – Cucurbitaceae Plasmopara halstedii - Helianthus sp. Erysiphales: Golovinomyces cichoracearum - Lactuca spp. Podosphaera xanthii, Golovinomyces cichoracearum - Cucurbitaceae Oidium neolycopersici - Lycopersicon spp. Deuteromycetes: Fusarium spp. - Pisum sativum

Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství Sbírka fytopatogenních mikroorganismů UPOC (fytopatogenních hub, vybraných fytoplazem a izolátů virů, a hospodářsky významných sinic a řas) Kolekce fytopatogenních hub odd. Oomycota Bremia lactucae 60 Hyaloperonospora parasitica 1 Pseudoperonospora cubensis 60 Říše Fungi Odd. Eumycota Pododd. Ascomycotina Podosphaera xanthii 5 Golovinomyces cichoracearum 4 Oidium neolycopersici 2 Pododd. Deuteromycotina Ascochyta fabae 1 Colletotrichum lindemuthianum 10 Fusarium spp. 27

Kolekce sinic a řas Druhů 33 izolátů Kolekce fytoplazem a izolátů virů Apple proliferation phytoplasma 2 Aster yellows phytoplasma 1 Elm yellows phytoplasma 2 European stone fruit yellows phytoplasma 1 Plum pox virus 6 Onion yellow dwarf virus 2 Pea enation mosaic virus 4 Pea seed borne mosaic virus 4

Udržování izolátů padlí tykvovitých Udržování izolátů plísně okurkové Padlí čekankové na rodu Lactuca

Stručný přehled cílů výzkumného záměru Variabilita složek a interakcí v rostlinném patosystému a vliv faktorů prostředí na jejich projev 1. Komplexní výzkum variability složek a interakcí v přírodním a kulturním rostlinném patosystému na různých úrovních jeho biologické a organizační hierarchie, včetně vlivů abiotických faktorů prostředí na jejich projev. (všichni zainteresovaní řešitelé) 2. Výzkum biodiverzity a genetické variability, časových a prostorových změn v populacích fytopatogenních organismů (viry, houby) a jejich hostitelů, včetně makro- a mikroevolučních aspektů změn struktury složek rostlinného patosystému. Identifikace, taxonomická a fylogenetická charakterizace nových patogenních forem v rostlinném patosystému. Tvorba jejich referenčních sbírek pro výzkumné účely. (skupina Prof. Lebedy a Doc. Navrátila)

3.1. Stručný přehled cílů výzkumného záměru 3. Fenotypová variabilita interakcí rostlina-patogen na úrovni jedinců i populací a vliv faktorů prostředí na jejich projev. Studium rezistence v genových zdrojích vybraných kulturních rostlin, ale i jejich planě rostoucích progenitorů. Detekce různých mechanismů rezistence v genových zdrojích rostlin a jejich pravděpodobné genetické podstaty. Strategie využití těchto zdrojů v rostlinných biotechnologiích a šlechtění rostlin. (skupina Prof. Lebedy) 4. Studium projevů a mechanismů interakcí rostlina-patogen-prostředí (abiotické stresové faktory) na histologické a cytologické úrovni; poznání úlohy, kterou mají vybrané histologické a cytologické aspekty v rozpoznání hostitele resp. nehostitele a v mechanismech rezistence rostlin. (skupina Prof. Lebedy, Doc. Navrátila a Prof. Nauše) 5. Fyziologické, biochemické a biofyzikální procesy podmiňující a doprovázející interakce mezi rostlinami, patogeny a prostředím; jejich význam v obranných reakcích rostlin a možnostech monitorování jejich fyziologického stavu. Využití těchto přístupů k výzkumu biologicky a chemicky systémově indukované rezistence rostlin, včetně hlubšího poznání její fyziologické/biochemické podstaty. (skupina Prof. Peče, Prof. Lebedy a Prof. Nauše)

3.1. Stručný přehled cílů výzkumného záměru 6. Molekulárně-genetická analýza variability rostlinného patosystému a jeho jednotlivých složek na úrovni polymorfismu a exprese mRNA a proteinů. Stanovení polymorfismu genomických nukleových kyselin a identifikace genů nebo genomických segmentů odpovědných za rezistenci rostlin resp. nebo patogenezi fytopatogenních organismů. (skupina Prof. Lebedy a Doc. Navrátila) 7. Matematické modelování a modelové experimenty sloužící k ověření některých fyziologických a biofyzikálních procesů spojených s reakcemi rostlin na působení abiotických a biotických stresových faktorů. (skupina Prof. Nauše) 8. Integrace získaných poznatků o variabilitě, struktuře a chování rostlinného patosystému, jejich teoretická a praktická interpretace. (všichni zainteresovaní řešitelé)

Výzkum biodiverzity a genetické variability, časových a prostorových změn v populacích fytopatogenních virů a hub Identifikace nového potyviru Daphne mosaic virus (DapMV) izolovaného z lýkovce Studium biodiverzity virů česneku; molekulární charakterizace izolátů LYSV původem z České republiky a Číny Výskyt PPV na různých lokalitách a hostitelích v České republice; molekulární charakteristika PPV-Rec izolátu infikujícího třešeň Výskyt PPV kmenů na střední a jižní Moravě na lokalitách s intenzivními výsadbami a jejich molekulárně biologická charakterizace Molekulárně biologická charakteristika viru mozaiky hrachu přenosné semenem (PSbMV) Epidemiologie fytoplasmy stolburu Studium rozšíření, škodlivosti a variability patogenity na úrovni jedinců i populací u Pseudoperonospora cubensis, Bremia lactucae, Golovinomyces cichoracearum a Podosphaera xanthii Byly popsány nové patogenní druhy padlí (např. Erysiphe pachypodii), nebo pro území ČR dosud neznámé druhy padlí na Rhododendron spp. a Homalocladium sp. Výzkum rezistence fytopatogenních hub (Peronosporales, Erysiphales) k fungicidům

Jehličnany Meruňky trnka ??? Jiní hostitelé XI - XII I II – III – IV V – VI – VII – VIII – IX - X Jehličnany Meruňky trnka ??? Jiní hostitelé Recently OYDV has been reported worldwide, often in mixed infection with LYSV, GaCLV, SLV and GarMbFV. Main host species in the CZ reprezeneted In Asia EPIDEMIOLOGIE FYTOPLAZMY EVROPSKÉ ŽLOUTENKY PECKOVIN (ESFY)

CP P-1 P-2 P-4 P-3 Fylogenetická Analýza ČESKÝCH IZOLÁTŮ PSbMV (virus mozaiky hrachu) 0.1 PSB117CZ (EU293758) PSB118CZ (EU293760) PSBDCZ (EU293763) PSB141CZ (EU293760) PSBECZ (EU293764) WI-1 (AF023143) NZ (D10453) U16215 PSbMV-28 (AF023146) PK9 (AF127769) Wa-1 (AF023144 ) Sv (AF023151) DPD1 (D10930) PSB262CZ PsP2 (AF023145) GER (Z48509 ) PSB194CZ PSB204CZ PSB178CZ (EU293761) PSB329CZ (EU293762) SL-25 (AF023147) US (AF127768) CAN (Z48508) L1 (AJ252242) I-1 (AF023148) NY (X89997) NY (X87938) S6 (AF023150) S6 (AF127767) PSB58CZ (EU293765) EG-1 (AF023152) EGYPTIAN (AF522162) NEP1 (AF023149) Cluster I Cluster III Cluster IV Cluster V Cluster II CP P-1 1000 1000 1000 OYDV is transmitted by Aphids in non-perisistent manner. A don´t create collonies of on Allium leaves, and virus is transmitted only by flying generation P-2 P-4 1000 1000 P-3

POPIS NOVÝCH DRUHŮ FYTOPATOGENNÍCH ORGANISMŮ A NOVÝCH VÝSKYTŮ FYTOPATOGENNÍCH ORGANISMŮ Padlí na Pachypodium lamerei - Erysiphe pachypodii Padlí na Homalocladium platycladum - Erysiphe polygoni DC. – prvovýskyt v ČR

Sběr fytopatogenních organismů v terénu Hodnocení rezistence/ náchylnosti genotypů vůči fytopatogenním organismům

Analýza virulence populací B. lactucae Porovnání frekvence faktorů virulence v populacích B. lactucae v přírodním a kulturním patosystému Lactuca – B. lactucae v roce 2004 Vysvětlivky: v1, v2, v3, v4, v10, v12, v13, v14 - v-faktory komplementární Dm genům nebo R-faktorům v odrůdách L. sativa v7, v15, v16, v17, v23, v24, v25, v26, v27, v28, v29, v30 - v-faktory komplementární Dm genům nebo R-faktorům v L. serriola v5/8, v6, v11, v18, v38, v41, v42 - v-faktory komplementární Dm genům v L. sativa odvozeným z L. serriola v32, v33, v36, v37 - v-faktory komplementární Dm genům v L. sativa odvozeným z L. saligna v35 - v-faktor komplementární Dm genu v L. sativa odvozenému z L. virosa vSp - virulence vůči odrůdě Spartan Lakes, gen rezistence odpovědný za reakci dosud nebyl popsán (Dm1+?) vPI - virulence vůči genotypu L. serriola (PI 273617), gen rezistence odpovědný za reakci dosud nebyl popsán (R?) vCR - virulence vůči genotypu L. serriola x L. sativa (CS-RL), gen rezistence odpovědný za reakci dosud nebyl popsán (R18+?)

Mechanismy rezistence rostlin (anatomie, fyziologie, biochemie, biofyzika, molekulární biologie a genetika) Realizovány byly pokusy orientované na chování a klíčení biotrofních houbových parazitů na povrchu epidermis hostitelských rostlin Změny optických parametrů listů pod vlivem patogenního působení Vliv teploty a světla na chování patogenu a projevy rezistence resp. náchylnosti Časování interakce hostitel-patogen (timing ve vztahu k expresi genů rezistence) Studium dynamiky reprodukčních procesů virů, včetně zavedení a optimalizace metody jejich kvantifikace pomocí Real-Time PCR Na modelové interakci Lactuca spp.-B. lactucae byly studovány otázky hypersenzitivity a buněčné smrti, a jejich úlohy v rezistenci rostlin Buněčné a biochemické aspekty apoptózy byly studovány na mutantu 7B-1 rajčete v souvislosti s jeho citlivostí k fytotoxinu koronatinu, izolovaného z Pseudomonas syringae pv. glycine, a to v závislosti na kvalitě světla Zahájen byl rovněž rozsáhlý výzkum úlohy cytokininů (např. meta-topolinu) a vlivu jejich exogenní aplikace na procesy patogeneze a expresi rezistence rostlin

Vliv infekčního procesu biotrofních parazitů na vlastnosti buněčných membrán a fotosyntetické parametry Změny antioxidačního systému a xantofylového cyklu při umělé senescenci a oxidativním stresu Aktivitu aminoxidasy a řady antioxidačních enzymů u Pisum sativum v průběhu infekce Fusarium oxysporum a Fusarium solani Studium aktivních forem kyslíku a antioxidačních enzymů při interakci Lycopersicon spp.-Oidium neolycopersici a Lactuca spp.-Bremia lactucae Lokalizace produkce aktivních forem kyslíku a studium antioxidačních enzymů u Lactuca spp. během patogeneze Bremia lactucae Aktivitu enzymů podílejících se na metabolismu biogenních aminů u hrachu setého v podmínkách salinitního stresu Aminoaldehyddehydrogenasovou aktivitu u hrachu setého po mechanickém poškození Interakce rostlinné aminoxidasy s diaminoethery a s novou sérií diaminových derivátů, včetně jejich syntézy Časná detekce stresu rostlin na základě změn statistické distribuce fluorescence chlorofylu

Produkci NO a změny NOS aktivity v průběhu patogeneze u interakce Lycopersicon spp. - O. neolycopersici, Cucumis sativus a Cucumis melo - Golovinomyces cichoracearum, Lactuca spp. - B. lactucae Studium role NO při salinitním stresu u rostlin, nitrace proteinů v průběhu stresové reakce u rostlin Výzkum vlivu NO na regeneraci rostlinných protoplastů Úlohu polyaminů v průběhu patogeneze u modelové interakce Lycopersicon spp.-O. neolycopersici Rovněž byly realizovány a probíhají experimenty zaměřené na řešení otázek systémová reakce rostlin na lokální stres, sledovaný pomocí elektrických potenciálů, parametrů fotosyntézy a signálních molekul Tvorba reaktivních forem kyslíku v thylakoidních membránách a vliv chelátorů

Primární infekční struktury B. lactucae: s- spora, a- apresorium, pv- primární vezikulus, sv- sekundární vezikulus V infikovaných epidermálních buňkách Lactuca spp. dochází k přestavbě cytoskeletu - na obr. mikrotubulární “košíček”, který se vytváří kolem infekčních struktur B. lactucae

L. esculentum Amateur L. chmielewskii Kontrola SNP Lokalizace NO pomocí konfokálního mikroskopu s DAF-FM na genotypu L. chmielewskii infikovaném O. neolycopersici (24hpi) PTIO Konidie O. neolycopersici na genotypech Lycopersicon spp. lišících se stupněm rezistence 48 hpi.

MEZINÁRODNÍ SPOLUPRÁCE Virologický ústav SAV, Bratislava, Slovakia - rostlinná virologie, studium variability izolátů r. Potyvirus Jagellonian University, Krakov, Poland - ochranné mechanismy rostlin Institute of Plant Genetics and Crop Research, Gene Bank, Seed Storage Unit, Gatersleben, Germany – genové zdroje rostlin Technical University Munich, Faculty of Life and Food Sciences, Department of Plant Pathology, Freising-Weihenstephan, Germany - interakce hostitel-patogen Institute for Plant Virology, Microbiology and Biosafety, Braunschweig, Germany - rostlinná virologie, studium variability izolátů r. Potyvirus University of Geneva, Geneva, Switzerland - primární reakce fotosyntézy INRA Bordeaux, France - rostlinná virologie, studium variability izolátů r. Potyvirus UMR Physiologie et Biotechnologie Vegetales IBVI-INRA Bordeaux, 33883 Villenave d'Ornon Cedex, France - genová exprese u mutanta rajčete pomocí microarray IVIA (Instituto Valenciano de Investigatigaciones Agraria), Valencia, Spain - rostlinná virologie, studium variability izolátů r. Potyvirus Wageningen University, Laboratory of Plant Breeding, Wageningen, The Netherlands – molekulární markery rostlin Centre for Genetic Resources, The Netherlands Cluster Plant Genebank, Wageningen, The Netherlands – genové zdroje rostlin Plant Research International, Wageningen, The Netherlands

MEZINÁRODNÍ SPOLUPRÁCE Agriculture Institute of Slovenia, Ljubljana, Slovenia – molekulární markery u genových zdrojů rostlin Warwick University, Horticulture Research International, Genetic Resources Unit, Wellesbourne, Warwick, U.K. – genové zdroje rostlin, mechanismy interakce rostlina-patogena University of the West England, School of Life Sciences, Bristol, U.K. – biologie peronosporálních organismů Agricultural Research Organization, Newe Yaar Research Center, Vegetable Crops, Haifa, Israel – diversita Cucurbitaceae University of Haifa, Institute of Evolution, Haifa, Israel – genové zdroje rodu Lactuca, diversita velikosti genomu ve vztahu k faktorům prostředí Wisconsin University, Department of Horticulture, Madison, Wisconsin, USA – biologie a šlechtění Cucurbitaceae Iowa State University, Plant Introduction Station, Ames, Iowa, USA – diversita genových zdrojů Cucurbitaceae a jejich interakce s biotrofy University of California, Genome Centre, Davis, California, USA – výzkum genetické diversity Lactuca spp. United States Department of Agriculture, Agricultural Research Station, Salinas, California, USA - výzkum genetické variability Lactuca spp., rezistence Cucumis spp. vůči padlí

Dosažené výsledky z hlediska jejich přínosu pro rozvoj oboru Genetická variabilita populací fytopatogenních organismů, její klasifikace, dynamika a mikroevoluce Detekce nových fytopatogenních organismů (virů a hub) Rozvoj sbírek fytopatogenních organismů Detekce nových zdrojů rezistence v genových zdrojích rostlin Rozvoj sbírek genových zdrojů rostlin, jejich charakterizace a výzkum Struktura a interakce přírodního a kulturního rostlinného patosystému Obranné mechanismy rostlin vůči biotrofním parasitům Molekulární variabilita genových zdrojů rostlin a jejich patogenů Klonování genu 7B-1, jehož mutace vede k rezistenci rostlin k abiotickým stresům specificky na modrém světle. Identifikace nového genu v genomu rajčete, identifikace nové funkce již známého genu. Časná detekce stresu rostlin pomoci změny ve statistice fyziologických a biofyzikálních parametrů

POŘÁDÁNÍ KONFERENCÍ A SEMINÁŘŮ „ECP/GR (European Cooperative Programme/Genetic Resources)“ Vegetables, Medicinal and Aromatic Plants Network The Leafy Vegetables Working Group, Olomouc (Czech Republic) 13-14 October 2005 (předseda vědeckého a organizačního výboru: A. Lebeda) „The Downy Mildews, 2nd International Symposium“, Olomouc 2.-6.7.2007, www.downymildews. upol.cz (předseda vědeckého a organizačního výboru: A. Lebeda; příprava od r.2005) „Protozoa a Chromista, taxonomie, biologie a hospodářský význam“, Symposium ČFS, Praha, 15.3.2007 (předseda vědeckého a organizačního výboru: A. Lebeda; příprava od r. 2006) „British Mycological Society Overseas Field Meeting“ Olomouc, 5.-13.10.2009 (A. Lebeda, P. Spencer-Phillips) Kromě českých organizátorů a průvodců, všichni ostatní účastníci byli ze zahraničí) „ Fytoplazmy - významné patogeny rostlin“ Olomouc, 9.4.2008. Organizátoři: Navrátil, M., Fialová, R.

Lebeda, A. , Spencer-Phillips, P. T. N. , Cooke, B. M. (eds Lebeda, A., Spencer-Phillips, P.T.N., Cooke, B.M. (eds.): The Downy Mildews - Genetics, Molecular Biology and Control Tato monografie, vydaná nakladatelstvím Springer, je zaměřená na různé aspekty fytopatogenních peronosporálních organismů, a vznikla jako přímý výstup z mezinárodní konference (80 účastníků) "The Second International Downy Mildews Symposium", pořádané ČFS a konané 2.-6.7.2007 v Olomouci. Kniha vyšla jako "spin-off book", paralelně byly všechny příspěvky publikovány i v impaktovaném časopise European Journal of Plant Pathology (122:1, 2008).

Sborník Navrátil, M., Fialová, R. (eds.): Fytoplazmy - významné patogeny rostlin Sborník byl připraven jako soubor přednášek, které zazněly na semináři "Fytoplazmy - významné patogeny rostlin", který pořádala ČFS dne 9.4.2008 v Olomouci.