Úvod do studia cytologie a histologie Základní pojmy. Metody studia buněk a tkání. Histologický preparát. Odběr, fixace, značení a zpracování vzorků. Základy mikroskopování. Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241

Histologické vyšetření: součást klinických vyšetřovacích metod umožňuje stanovit diagnózu, rozpoznání nemoci je předpokladem správné léčby pacienta metoda vědecké práce Histologická technika soubor postupů, metod a přístupů, které vedou ke zhotovení preparátu Preparát: tenký řez tkáně (pro světelnou mikroskopii 6-8µm) zpracován histologickou metodou zamontován pod krycí sklo připraven ke studiu pod světelným mikroskopem

Odběr materiálu Způsoby odběru: 1. Nekropsie – z mrtvého organismu, max. 12-24 h po smrti 2. Biopsie – ze živého organismu (peroperační biopsie) Odběr musí být rychlý, šetrný a bezpečný pro pacienta. Excize – vyříznutí skalpelem, žiletkou, nesmí se příliš poškodit tkáň Punkce – širší jehla se stříkačkou, např. kostní dřeň, játra, ledviny Mikroabraze – kyreta, vyšetření endometria Stěr, nátěr – tamponem nebo štětečkem se oloupou buňky, např. poševní cytologie Endoskopický odběr, laparoskopie Odebrané vzorky musí být okamžitě fixovány, označeny. Průvodní list k zásilce histologického materiálu.

4

Odběr materiálu Smrt – přerušení koordinační a obranné činnosti organismu, zásobení živinami a kyslíkem, odvodu metabolitů Autolýza – samovolný rozklad tkáně způsobený nekoordinovanou činností vlastních endogenních enzymatických systémů Hniloba – rozklad tkáně vnějšími činiteli (exogenní enzymy např. z bakterií, plísní) Autolýza i hniloba porušují strukturu a barvitelnost vzorku, takový vzorek nelze hodnotit. Zabránit znehodnocení lze rychlou fixací vzorku. Zásady odběru materiálu: Odebírat čerstvý materiál Šetrným způsobem Řádně označit Okamžitě fixovat Vyplnit průvodku

Fixace - rychlá a šetrná konzervace tkáně fixačními prostředky Fyzikální fixační prostředky: ovlivňují transportní funkci vody a tím naruší enzymaticky katalyzované reakce v buňkách - fixace působením nízké teploty: rychlé zmrazení, „suchý led“, zkapalněné plyny (tekutý dusík) - fixace vysušením tkáně za nízké teploty (freezing-drying): mrazová sublimace, histochemie – průkaz aktivity enzymů - fixace mikrovlnným zářením Chemické fixační prostředky Založeny na působení par nebo roztoků účinných látek – fixačních tekutin, které ve vhodné koncentraci vyvolávají jemnou a šetrnou denaturaci enzymových proteinů. Fyzikálně chemické metody - kombinace předchozích, např. chlazená fixační tekutina

Požadavky na fixaci musí rychle působit v celém vzorku musí dobře uchovat strukturu buněk a tkání musí umožňovat další požadované zpracování, vyšetření Z toho důvodu musí být vzorky přiměřeně velké: pro světelnou mikroskopii max. 1cm3, spíše ploténky. Fixační tekutiny musí být nadbytek – 20 až 50x větší objem. Vzorek se nesmí přilepit ke dnu ani plavat neponořený. Dostatečně velké hrdlo nádobky, řádné uzavření. Správné označení materiálu: nalepovací štítek + označení přímo ke vzorku. Nesmí dojít k záměně materiálu! Žádanka na histologické vyšetření.

Fixační prostředky Formol: 100% formol je 40% vodný roztok formaldehydu Nejpoužívanější, dostupný, relativně levný. Neutrální formol: neutralizovaný uhličitanem vápenatým (asi ¼ láhve), běžně používaná koncentrace je 10% Rychle proniká do tkáně, je šetrný, zachovává strukturu, dobře se po něm barví. Fixujeme asi 24h, menší kousky i méně, nemůžeme přefixovat. slaný formol (ředěný fyziologickým roztokem) pufrovaný formol Bakerova tekutina: 10% formol, chlorid vápenatý, voda Vhodná pro průkaz lipidů, enzymů vázaných na membrány.

Fixační prostředky Bromformol: 15% formol, bromid amonný Použití u impregnačních metod, průkaz gliových buněk v nervové tkáni. Bouinova tekutina: 25% formol, kys. pikrová, ledová kyselina octová - 5ml těsně před použitím Po fixaci se dává do 80% etanolu. Nemůže přefixovat. Nevýhody: nehodí se pro fixaci krevnatých orgánů, není vhodná pro průkaz lipidů

Fixační prostředky Fixační tekutiny se sublimátem: SUSA: sublimát (chlorid rtuťnatý), chlorid sodný, formol, destilovaná voda, kyselina trichloroctová, před použitím ledová kyselina octová Výborná pro cytologii, kosti, zuby, chrupavky. Přenáší se rovnou do 90% etanolu, v němž se provádí jódování. Jódování – odstranění sublimátových sraženin (vznikají při fixaci) např. v Lugolově roztoku či jódové tinktuře. Zenkerova tekutina: sublimát, dvojchroman draselný, síran sodný, destilovaná voda, ledová kyselina octová, NENÍ FORMOL! Fixace 24h, pak vypírání bločku v tekoucí vodě (24h), pak 70% etanol a jódování.

Fixační prostředky Etanol: použití zejména v neurohistologii – Nisslova metoda. Tkáň se značně dehydratuje a extrahují se tuky – zvýraznění komplexů granulárního endoplazmatického retikula (Nisslova substance), ta se pak barví např. thioninem. Aceton: 0-40C, enzymová histochemie Osmiumtetroxid: základní prostředek fixace v technice elektronové mikroskopie. Pro světelnou mikroskopii se nehodí – proniká pomalu do tkáně.

Zalévání Pro běžné histologické vyšetření je potřeba odebraný a fixovaný materiál nakrájet na řezy 4-8µm silné. Po prosycení tkáně tekutým zalévacím médiem médium ztuhne a zvýší konzistenci (tvrdost, pevnost) vzorku, což umožní krájet tenké řezy. 1. Média rozpustná ve vodě: celodal, želatina, metakrylátové umělé pryskyřice Výhodná proto, že po fixaci a vyprání ve vodě můžeme přímo prosycovat, zalévat a tvrdit. 2. Média nerozpustná ve vodě: parafin, celoidin, umělé epoxidové pryskyřice Zalévání do těchto médií vyžaduje nejprve důkladné odvodnění vzorku a prosycení intermédiem (látka, která se mísí s odvodňujícím i zalévacím médiem). Teprve pak prosycujeme zalévacím médiem.

Zalévání do parafínu Nejpoužívanější metoda, nevhodná ale k zalévání tuhých tkání, průkazu lipidů. Nevýhoda: smrštění tkáně při odvodnění, prosycování při vysoké teplotě Etapy: A/ odvodnění tkáně – dehydratace Vzestupná řada alkoholů - etanolu (30-50-70-80-90-96-100%) - musí být šetrné, první použitá koncentrace závisí na obsahu vody ve tkáni (např. embryonální tkáně začínají 30%, šlacha či zub i 90%, po fixaci Bouinovou tekutinou 80%, SUSA 90%) - každá lázeň několik hodin, 2x se vyměňuje, celkem 1-2 dny B/ prosycení tkáně intermédiem, projasnění benzen, xylen, toluen, metylsalicylát, metylbenzoát Intermédium musí rozpouštět parafín a mísit se se 100% alkoholem. Vysoký index lomu, provádí se ve 3 lázních po 15 minutách.

C/ prosycení tekutým parafínem parafín 560C 3 lázně parafínu při 560C, 1. lázeň asi 2-4h, 2. lázeň 4-6h, 3. lázeň 8-12h, celkem cca 24 hodin. Teplota nesmí překročit 580C. D/ vlastní zalití V zalévací komůrce, používá se výhradně zkvalitněný parafín (zahřátí na 800C, přidá se 3-5% včelího vosku a přefiltruje). Bloček se přenese pinzetou, nahřátou preparační jehlou se zorientuje, nechá ztuhnout. Stále u vzorku musí zůstat značení. E/ tvrzení média Rovnoměrné tuhnutí při pokojové teplotě, úprava bločku, přitmelení na podložku. Pro rutinní zpracování histologických vzorků se používají zalévací automaty. 14

Zalévání do celoidinu Zalévání do želatiny Použití: tuhé tkáně, šlachy, chrupavky, zuby, odvápněné kosti Výhoda: pokojová teplota Nevýhody: trvá dlouho, nelze použít pro lipidy, nádobky musí být dobře uzavřené Postup: - odvodnění vzestupnou řadou alkoholů - prosycení alkoholéterem - vzestupná řada celoidinu (2%,4%,8%,10%) - vlastní zalití do 10% celoidinu a tuhnutí - tvrzení bločku v 70-80% alkoholu Zalévání do želatiny Použití: řídké struktury – placenta, sliznice střeva, průkaz lipidů ad. Postup: - vyprání ve vodě - prosycení želatinou ve stoupajících koncentracích (10% a 15% vodný roztok) - vlastní zalití do 15% nebo 20% roztoku želatiny v komůrce - tvrzení v 10-20% formolu Krájení na kryostatu!

Krájení řezů Krájí řezy cca 6-10 µm Sáňkový mikrotom: krájí parafín, celoidin, celodal Rotační mikrotom: parafínové bloky – zhotovení sériových řezů, např. embryologie Zmrazovací mikrotom – krájení tkání nezalitých, zalitých do želatiny

Napínání a lepení parafínových řezů Řezy se napínají na vodní hladině (povrchové napětí) a lepí na podložní sklo např: směsí bílku a glycerinu 1:1 Nelze použít např. pro imunohistochemii, impregnaci. Na sklíčko se rozetře bílek s glycerinem, přenese se řez a podlije destilovanou vodou. Natažení na napínací ploténce. Označení podložního skla! Sušárna. roztokem želatiny 0,5 až 1% Řezy se podlévají želatinou, sušárna, koagulace želatiny.

Světelný mikroskop Mechanická část: stativ, stolek, šrouby Optická část: objektiv, okulár Osvětlovací zařízení: světlo, kondenzor, clony Druhy objektivů: suché, imerzní Rozlišovací schopnost mikroskopu dána jeho stavbou a optickými vlastnostmi objektivu je vyjádřena numerickou aperturou. NA = n*sin α n je index lomu media, α je polovina otvorového úhlu objektivu Rozlišovací schopnost je minimální vzdálenost 2 bodů, které můžeme rozlišit, mezní hodnota u světelného mikroskopu při použití šikmého osvětlení je asi 0,2μm. Přednášková prezentace je určena výhradně pro osobní studium studentů 1. LF UK.