Kvantitativní RT-PCR Praha 19.5.-23.5.2003
Kvantitativní RT-PCR Náplň: různé metody kvantifikace mRNA - komparativní RT-PCR, kompetitivní RT-PCR a real-time PCR Kvantifikace transkriptů cyklinu D1, BCR-ABL a beta-2-mikroglobulinu - prakticky izolace RNA a reverzní transkripce - prakticky
Izolace celkové RNA Fenol (Chomczynski) Gradient CsCl Firemní kolonky Kationtové detergenty
Izolace mRNA Oligo dT na nosiči (např. magnetické kuličky
Primers pro revezní transkripci Oligo dT Univerzální, nižší výtěžek, nízká Tm Random hexamers/dekamers Univerzální, vyšší výtěžek, krátké úseky, nízká Tm Specifický primer Specifický, vyšší výtěžek, vysoká Tm, primer možno použít pro následnou PCR
Enzymy pro reverzní transkripci Revezní transkriptázy AML,M-MuLV DNA pomlymérázy s reverzně transkriptázovou aktivitou Tth, C. therm.
ELFO celkové RNA Jedenotlivé bandy tRNA 28S,18S,5S
Průběh PCR
Průběh PCR
Jednotlivé metody kvantifikace Komparativní PCR Kompetitivní PCR – kompetitor/ polykompetitor (konstrukt) Real Time – PCR
Kompetitivní PCR Koncové koncentrace produktů jsou ve stejném poměru jako koncentrace templátů i ve fázi plató Kontrola „tube to tube variation“ agar ELFO s EtBr (v pufru) Korekce na různou délku kompetitoru a stanovovaného genu Kompetitory umělé/přirozené
Real Time PCR Sledování růstu fluorescence v průběhu PCR Různé chemikálie (sondy) Různá instrumentace
Kontrolní gen a návrh primerů Pseudogeny Junction primers Konstitutivní exprese
Transport a uchovávání vzorků In vivo Periferní krev v citrátu s glc 3 dny EDTA do 24 hod Lyzát v guanidium isothiocyanát (ITG) Precipitát
Technické poznámky Zdroje kontaminace inhibující PCR Kontaminovaný olej Talek Pyl z okolního prostředí Boj s kontaminacemi Oddělené laboratoře Měnit rukavice, používat sterilní buničinu „dlouhé“ špičky s filtrem Oddělit pipety na roztoky a vzorky
Dekontaminace Oxidační činidla Uhlíkový filtr do laminárního boxu SAVO UV ???? Uhlíkový filtr do laminárního boxu Voda prostá RNA-áz (DEPC diethylpyrocarbonat, aqua pro inj.)