Kvantitativní RT-PCR Praha 19.5.-23.5.2003.

Slides:



Advertisements
Podobné prezentace
Transkripce (první krok genové exprese: Od DNA k RNA)
Advertisements

Pátráme po mikrobech Díl IX. Průkaz nukleové kyseliny
Studium lidského genomu
CHARAKTERIZACE DNA.
Exprese genů cig1 a CRK1 v rostlině tabáku cig1 = cytokinin-induced gene 1 CRK1 = cytokinin-regulated kinase 1.
Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, katedra analytické chemie.
Vyšetření parametrů buněčné imunity
Masarykova nemocnice, o.z.
GENETICKÁ TRANSFORMACE BAKTERIÍ
Transkripce (první krok genové exprese)
Transkripce (první krok genové exprese)
Synoviální sarkom Ravčuková B1. , Kadlecová J1. , Štěrba J 2
Real-time PCR - princip
Transkripce a translace
Laboratoř potravinářské mikrobiologie (Rokoska)
Molekulární diagnostika neurofibromatózy typu 1 Kratochvílová A., Kadlecová J., Ravčuková B., Kroupová P., Valášková I. a Gaillyová R. Odd. lékařské genetiky,
Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD.
Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA
Izolace RNA z živočišné tkáně
Transkriptom.
(genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích) RNA
Klinická cytogenetika - metody
F.I.S.H. hotovo.
Marie Černá, Markéta Čimburová, Marianna Romžová
GENETICKÁ INFORMACE je informace, která je primárně obsažena v nukleotidové sekvenci v nukleotidových sekvencích jsou obsaženy následující informace: o.
Autor: Milan Blaha Konzultant: Prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc.
EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE Transkripce
Radovan Horák, Romana Zaoralová, Jiří Voller
RNA savčí buňka: pg celkové RNA rRNA (28S,18S, 5S) 80-85%
Analýza a separace nukleových kyselin
Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012.
Analýza mutace C282Y v genu pro hemochromatózu
PCR Polymerase Chain Reaction
Kvantifikace nukleových kyselin
DNA diagnostika II..
Transkripce a translace
Mária Ol’hová, Veronika Frkalová, Petra Feberová
2014 Výukový materiál GE Tvůrce: Mgr. Šárka Vopěnková Projekt: S anglickým jazykem do dalších předmětů Registrační číslo: CZ.1.07/1.1.36/
Expresní DNA microarray
Bezpečnost práce při praktických cvičeních z MB
Technologické aspekty čipových technologií Boris Tichý LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno.
Praktikum z genetiky rostlin JS Genetické mapování mutace lycopodioformis Arabidopsis thaliana Genetické mapování genu odolnosti k padlí.
Moderní metody buněčné biologie
Párováni bazí, hybridizace a denaturace DNA/RNA hraje důležitou roli v přírodě i aplikacích: - struktura DNA a duplikace genetické informace - transkripce.
Mikročipy ..
RNA savčí buňka: pg celkové RNA rRNA (28S,18S, 5S) 80-85% tRNA, snRNA 15-20% mRNA 1-5% mRNA molekul/buňku, tj rozdílných transkriptů.
SEKVENOVÁNÍ DNA. Jedna z metod studia genů Využití v aplikovaných oblastech molekulární biologie – např. medicíně při diagnostice genetických chorob.
PRŮKAZ NUKLEOVÉ KYSELINY Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU
Environmentální aplikace molekulární biologie
Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese
qRT-PCR Kryostat Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Mgr. Martina Lánová RNDr. Josef Večeřa, Ph.D. Bc.
Lékařská mikrobiologie I Růst bakterií, růstová křivka
C7188 Úvod do molekulární medicíny 3/12
Klonování DNA a fyzikální mapování genomu
RT – PCR: návrh primerů.
Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA
Pátráme po mikrobech Díl IX. Průkaz nukleové kyseliny
SMAMII Amplifikační metody.
Separace molekul nukleových kyselin centrifugací
„Next-Gen“ Sequencing
Izolace genomové DNA Základní kroky: Biologický materiál:
Polymerase chain reaction Polymerázová řetězová rekce
Metagenomika - Metatranskriptomika
Studium lidského genomu
Od DNA k proteinu - v DNA informace – geny – zápis ve formě 4 písmen = nukleotidů = deoxyribóza, fosfátový zbytek, báze (A, T, C, G) - DNA = dvoušroubovice,
1. Regulace genové exprese:
18b-Metody studia nukleových kyselin
MiRNA
Molekulární biologie (c) Mgr. Martin Šmíd.
Transkript prezentace:

Kvantitativní RT-PCR Praha 19.5.-23.5.2003

Kvantitativní RT-PCR Náplň: různé metody kvantifikace mRNA - komparativní RT-PCR, kompetitivní RT-PCR a real-time PCR Kvantifikace transkriptů cyklinu D1, BCR-ABL a beta-2-mikroglobulinu - prakticky izolace RNA a reverzní transkripce - prakticky

Izolace celkové RNA Fenol (Chomczynski) Gradient CsCl Firemní kolonky Kationtové detergenty

Izolace mRNA Oligo dT na nosiči (např. magnetické kuličky

Primers pro revezní transkripci Oligo dT Univerzální, nižší výtěžek, nízká Tm Random hexamers/dekamers Univerzální, vyšší výtěžek, krátké úseky, nízká Tm Specifický primer Specifický, vyšší výtěžek, vysoká Tm, primer možno použít pro následnou PCR

Enzymy pro reverzní transkripci Revezní transkriptázy AML,M-MuLV DNA pomlymérázy s reverzně transkriptázovou aktivitou Tth, C. therm.

ELFO celkové RNA Jedenotlivé bandy tRNA 28S,18S,5S

Průběh PCR

Průběh PCR

Jednotlivé metody kvantifikace Komparativní PCR Kompetitivní PCR – kompetitor/ polykompetitor (konstrukt) Real Time – PCR

Kompetitivní PCR Koncové koncentrace produktů jsou ve stejném poměru jako koncentrace templátů i ve fázi plató Kontrola „tube to tube variation“ agar ELFO s EtBr (v pufru) Korekce na různou délku kompetitoru a stanovovaného genu Kompetitory umělé/přirozené

Real Time PCR Sledování růstu fluorescence v průběhu PCR Různé chemikálie (sondy) Různá instrumentace

Kontrolní gen a návrh primerů Pseudogeny Junction primers Konstitutivní exprese

Transport a uchovávání vzorků In vivo  Periferní krev v citrátu s glc 3 dny EDTA do 24 hod Lyzát v guanidium isothiocyanát (ITG) Precipitát

Technické poznámky Zdroje kontaminace inhibující PCR Kontaminovaný olej Talek Pyl z okolního prostředí Boj s kontaminacemi Oddělené laboratoře Měnit rukavice, používat sterilní buničinu „dlouhé“ špičky s filtrem Oddělit pipety na roztoky a vzorky

Dekontaminace Oxidační činidla Uhlíkový filtr do laminárního boxu SAVO UV ???? Uhlíkový filtr do laminárního boxu Voda prostá RNA-áz (DEPC diethylpyrocarbonat, aqua pro inj.)