Inhibitory a aktivátory

Inhibitory Látky snižující rychlost enzymově katalyzované reakce Látky nejrůznější povahy – ionty, organické i anorganické látky Nízkomolekulární i vysokomolekulární látky Vyvolávají buď změnu struktury molekuly enzymu, nebo konkurují substrátu

Klasifikace inhibitorů Podle původu (přirozené a umělé) Podle specifity účinku (specifické a nespecifické) Reversibilní (možno odstranit dialysou) a ireversibilní (nemohou být odstraněny dialysou) Podle mechanismu působení (reversibilní) - kompetitivní nekompetitivní akompetitivní smíšené Rozlišení typů inhibice Podle změn Vmax a KM u inhibované a neinhibované reakce

Význam inhibitorů Regulace enzymové aktivity Studium enzymové aktivity Zásahy do látkové přeměny organismů - léčiva (antibiotika, cytostatika) - herbicidy, insekticidy - vojenské bojové látky

Kompetitivní inhibitory Mají strukturu podobnou substrátu (buď celá molekula, nebo část uplatňující se při vazbě na enzym) V přítomnosti inhibitoru se vytváří inaktivní komplex enzym-inhibitor Tvorba komplexu s inhibitorem je vratná Za přítomnosti substrátu dochází ke kompetici Účinek inhibitoru lze zcela odstranit dostatečně vysokou koncentrací substrátu Často využívány jako léčiva

Kompetitivní inhibitory

Kompetitivní inhibice Produkt Substrát Kompetitivní inhibitor Sukcinát Glutarát Malonát Oxalát C-OO- C-H C-OO- H-C-H C-OO- H-C-H C-OO- H-C-H C-OO- 競爭性 抑制劑通常都與正常的基質相像，可以與酵素結合，但無法繼續反應，產生生成物；因為都是競爭同一活性區，因此可提高基質來對抗抑制。 Sukcinátdehydrogenasa

Kompetitivní inhibitory

Kompetitivní inhibice k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 E + I  EI KI = [E][I] / [EI] KI = inhibiční konstanta

Kompetitivní inhibice - kalkulace [E]tot = [E] + [ES] + [EI] [E]tot = [E] + [ES] + [E][I] / KI [E]tot = [E] (1 + [I]/KI) + [ES] Vyjádříme [E] : [E] = [E]tot - [ES] / (1 + [I]/KI) KI = [E][I] / [EI]

Kompetitivní inhibice - kalkulace Víme že: Rozšíříme poslední rovnici členem [S] / [ES] [E] = [E]tot - [ES] / (1 + [I]/KI)  [E][S]/[ES] = KM = ([E]tot - [ES])[S] / (1 + [I]/KI)[ES] Vyjádříme [ES]

Kompetitivní inhibice - kalkulace [ES] = [E]tot [S] / (KM + [S] + KM[I]/KI) Analogická úprava jako v klasické rovnici MM (rozšíření obou stran rovnice výrazem kcat)

Kompetitivní inhibice Výnos podle Lineweaver-Burka Maximální rychlost reakce se nemění KM se u inhibované reakce zvyšuje

Sulfonamidy jako kompetitivní inhibitory Domagk (1939) Para-aminobenzoová kyselina (PABA) Bakterie potřebují PABA pro biosynthesu folátu -COOH H2N- Folát Tetrahydro- folát Prekursor -SONH2 H2N- Sulfonamidy mají podobnou strukturu jako PABA, a inhibují bakteriální růst. 磺胺藥 就是消炎藥，因為其構造類似細菌生長細胞壁所需之 PABA，會競爭性地抑制利用 PABA 的酵素，因而阻礙細菌的生長，但無法完全殺菌。 Sulfonamidy Tato metabolická dráha pro biosynthesu folátu se nenachází u člověka!

Nekompetitivní inhibitory Neovlivňují vazbu substrátu na enzym (neváží se do aktivního centra) Snižují rychlost přeměny substrátu na produkt Účinek inhibitoru je nezávislý na koncentraci substrátu Mechanismus účinku je založen na alosterickém efektu (inhibitor se váže mimo aktivní centrum a mění jeho konformaci na neaktivní) Inhibitor se váže na samotný enzym i na komplex enzym-substrát

Nekompetitivní inhibice

Nekompetitivní inhibice

Nekompetitivní inhibice Zjednodušující předpoklad: Substrát neovlivňuje vazbu inhibitoru na enzym Reakce E + I  EI a reakce ES + I  ESI mají stejné inhibiční konstanty KI

Nekompetitivní inhibice - kalkulace KI = [E][I] / [EI] [E]tot = [E] + [ES] + [EI] + [ESI] [E]tot = [E] + [ES] + [E][I] / KI + [ES][I] / KI [E]tot = ([E] + [ES]) (1 + [I]/KI) Vyjádříme [E] : [E] = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] - [ES] KI = [ES][I] / [ESI]

Nekompetitivní inhibice - kalkulace Víme že: Rozšíříme poslední rovnici členem [S] / [ES] [E] = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] - [ES]  [E][S]/[ES] = KM = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] [[S]/[ES]] - S Vyjádříme [ES] a provedeme analogickou úprava jako v klasické rovnici MM (rozšíření obou stran rovnice výrazem kcat). Získáme výraz:

Nekompetitivní inhibice - kalkulace

Nekompetitivní inhibice Výnos podle Lineweaver-Burka Maximální rychlost inhibované reakce se snižuje KM se u inhibované reakce nemění

Akompetitivní inhibitory Mohou se vázat na enzym až když vazba substrátu vhodně pozmění jeho konformaci Nereagují s volným enzymem! Vazbou na komplex enzym-substrát (vytvořením komplexu ESI) zabrání jeho přeměně na enzym a produkt Hlavně u dvousubstrátových reakcí (inhibitor se váže na vazebné místo pro druhý substrát) Existuje pouze několik případů

Akompetitivní inhibice

Akompetitivní inhibice

Akompetitivní inhibice Výnos podle Lineweaver-Burka Maximální rychlost i KM se u inhibované reakce snižuje stejnou měrou

Inhibice enzymové aktivity (mechanismy) kompetitivní nekompetitivní akompetitivní E Substrate E X Cartoon Guide Compete for active site Inhibitor Different site E + S → ES → E + P + I ↓ EI ← ↑ E + S → ES → E + P + + I I ↓ ↓ EI + S →EIS ← ↑ E + S → ES → E + P + I ↓ EIS ← ↑ Equation and Description 酵素 的抑制劑有不同的抑制機制，通常依照抑制劑對酵素的結合方式，可分成兩大類。其一為競爭同一活性區 (competitive)，可以用提高基質濃度的方法來競爭；另一則是結合在活性區之外的地方，又可分成 non-competitive 及 uncompetitive 兩種。後面兩種抑制方式大致相同，因此有些課本也就不再細分，其差別在於基質的結合，會不會影響抑制劑的結合。雖然這幾種抑制方式，都是可逆反應，但只有 competitive 可以用提高基質的方式來對抗抑制。 [I] binds to free [E] only, and competes with [S]; increasing [S] overcomes Inhibition by [I]. [I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] can not overcome [I] inhibition. [I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favors the inhibition by [I]. Juang RH (2004) BCbasics

Inhibice enzymové aktivity (grafy) kompetitivní nekompetitivní acompetitivní Vmax Vmax Km [S], mM Vmax [S], mM vo vo Direct Plots Double Reciprocal Vmax’ I Km’ Vmax’ I I Km Km Km’ [S], mM = Km’ Vmax unchanged Km increased Vmax decreased Km unchanged Both Vmax & Km decreased 1/[S] 1/Km 1/vo 1/ Vmax I 1/vo 1/ Vmax 1/[S] 1/Km 1/[S] 1/Km 1/ Vmax 1/vo I Intersect at X axis I Two parallel lines 這些 抑制機制都可以用酵素動力學來描述，使用雙倒數作圖更可明顯地指出是屬於何種抑制方式。不過，以上三種作圖都是屬於最典型者，很多時候實驗所得到的作圖結果，可能會有混合型態出現，則是較為複雜的抑制機制，或者有其他的干擾因子在內。 Intersect at Y axis Juang RH (2004) BCbasics

Ireversibilní inhibitory Enzym je kovalentně modifikován po interakci s inhibitorem Typickým příkladem jsou organofosfáty (insekticidy, nervové bojové látky)  ireversibilní inhibitory acetylcholinesterasy  tvoří kovalentní komplex s hydroxyskupinou serinu -SH skupiny cysteinu mohou být modifikovány alkylací E-SH + ICH2COO- E-S-CH2COO- + HI

Ireversibilní inhibitory

Ireversibilní inhibitory Tyto inhibitory jsou využívány pro studium aktivních center enzymů (díky kovalentní vazbě je možno v hydrolyzátu detegovat příslušnou aminokyselinu)

Studium aktivního místa chymotrypsinu Modifikace chymotrypsinu DIFP (diisopropylfluorfosfát) Modifikován pouze Ser 195 Ostatní serinové zbytky nejsou modifikovány Ser 195 se nachází v aktivním místě Proč je modifikován pouze Ser 195? Vyšší reaktivita díky sousedním aminokyselinám v aktivním centru

Studium aktivního místa chymotrypsinu Modifikace chymotrypsinu TPCK (N-tosylamido-L-phenylethylchloromethylketon) Modifikován pouze His 57 Ostatní histidinové zbytky nejsou modifikovány TPCK napodobuje substrát Proč je modifikován pouze His 57? Vyšší reaktivita díky sousedním aminokyselinám v aktivním centru His 57 je v aktivním místě enzymu His 57 a Ser 195 jsou blízko sebe

Inhibice substrátem Vysoká koncentrace substrátu Pokud molekula substrátu musí být vázána v aktivním centru vícebodovým záchytem  konkurence molekul substrátu o vazebná místa  nedokonalá orientace substrátu v aktivním centru Může způsobovat problémy při stanovení enzymové aktivity nebo při praktickém využití enzymů (enzymové technologie, biotechnologie)

Inhibice produktem Mechanismus zpětné vazby Zabrání se hromadění produktu

Aspartate transcarbamylase

Feedback Inhibition

Aktivace enzymů Aktivátory pozitivně ovlivňují rychlost enzymové reakce Váží se na molekulu enzymu vratně Typické příklady: Ca2+ (mnohé enzymy; pozor na používání fosfátových pufrů!), stabilizace proteinové struktury EDTA (odstranění inhibujících kovových iontů) -SH sloučeniny (např. merkaptoethanol) – reaktivace thiolových skupin cysteinu Chloridové ionty – aktivace živočišných α-amylas

Laboratoře z Enzymologie 2 dny (za sebou) v průběhu měsíce ledna Přednášky z Enzymologie www.usbe.cas.cz/people/safarik