Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie ivosaf@yahoo.com ivosaf@seznam.cz

Kde najdu informace? http://www.usbe.cas.cz/people/safarik/ Stránky v češtině Přednášky na Jihočeské universitě v Českých Budějovicích Enzymologie - Přednášky v PowerPointu, verze 2002 a 1995

Nauka o biokatalýze a biokatalyzátorech Enzymologie Nauka o biokatalýze a biokatalyzátorech

Enzymologie • studium struktury enzymů • studium kinetiky enzymových reakcí • studium reakčních mechanismů • studium forem a lokalizace enzymů • studium vztahu enzymů k patologii organismů • praktické využití enzymů • příprava a studium umělých enzymů

Co nás čeká ??? 1. Struktura bílkovin 2. Klasifikace a názvosloví enzymů, charakterizace jednotl. tříd enzymů 3. Koenzymy, jejich klasifikace, charakterizace, modifikace, využití 4. Struktura a funkce enzymů, mechanismy enzymových reakcí 5. Kinetika enzymových reakcí. Kinetika inhibice enzymových reakcí 6. Charakterizaci enzymů (MW, IEP, KM, pH a teplotní optimum.... 7. Metody pro stanovení enzymových aktivit 8. Inhibitory a aktivátory. Klasifikace, charakterizace, využití 9. Upstream processing 10. Downstream processing 11. Imobilizace a stabilizace enzymů 12. Aplikace enzymů 13. Nejnovější poznatky v enzymologii

Katalýza Katalýza - Berzelius 1838 Katalyzátor látky urychlující chemické reakce nemění rovnováhu chemických reakcí snižují aktivační energii

Biokatalyzátory globulární bílkoviny RNA - CZECH a ALTMAN (1986) jednoduchá x složená bílkovina více než 3000 enzymů v buňce enzymy jsou druhově specifické velmi účinné (až 5.104 molekul/s) specifita reakční, substrátová aktivní za mírných podmínek možnost regulace netoxické

Historie poznání enzymů 18 století: trávicí účinek žaludeční šťávy 1878: KŰHNE zavedl název ENZYM (En Zyme - v kvasnicích) 1897 - BUCHNER - extrakt kvasinek katalyzuje kvašení 1926 - SUMNER - bílkovinná povaha enzymů - ureasa

Enzymové technologie Použití isolovaných enzymů, enzymových komplexů a buněk Isolace enzymů Imobilizace enzymů, enzymových komplexů a buněk Enzymové procesy v nevodných systémech, micelách, dvoufázových systémech

Technické enzymy Proteasy (bakteriální) Syřidla Glukoamylasy Alfa-amylasy Glukosaisomerasy

Enzymy jsou proteiny Proteiny jsou složeny z 20 kódovaných aminokyselin L-enantiomery

Chemická struktura aminokyselin R představuje jeden z 20 různých typů postranních řetězců Hlavní řetězec je neměnný - základ peptidové vazby, existence dvou enantiomerních konfigurací, tvorba vodíkových můstků

Hlavní řetězec aminokyselin – vliv pH při fysiologickém pH mají volné aminokyseliny charakter amfiontu (“zwitterion”) pK COOH skupiny je mezi 1.7-2.6 pK NH2 skupiny je mezi 9.0-10.8 pI = 0.5 (pK1 + pK2) pH 1 pH 7 pH 11

aminokyseliny - optická aktivita alfa atom uhlíku je asymetrický pro 19 z 20 běžných aminokyselin (výjimkou je glycin, kde R = H). 19 aminokyselin se vyskytuje jako L-isomer. D-aminokyseliny jsou vzácné. L-isomer rovina souměrnosti D-isomer (vzácný) Threonin a isoleucin obsahují dva asymetické atomy uhlíku existují čtyři stereoisomerní formy

Klasifikace aminokyselin podle postranních řetězců hydrofobní hydrofilní - neutrální - kyselé - zásadité

Přehled aminokyselin 6 hydrofilních neutrálních postranních řetězců. Všechny obsahují =O, O-H nebo N-H skupiny které tvoří vodíkové můstky. 2 hydrofilní kyselé postranní řetězce. Obsahují karboxylové skupiny COO- s negativním nábojem při fysiologickém pH. pK 3.9 (aspartát) and 4.3 (glutamát). 3 hydrofilní basické postranní řetězce. Obsahují N-H skupiny (protonované u lysinu a argininu při fysiologickém pH). 9 hydrofobních postranních řetězců. Všechny obsahují zejména C-H vazby které málo interagují s molekulami vody. Jsou většinou uvnitř molekuly proteinu.

Šest hydrofilních neutrálních aminokyselin Tvoří vodíkové můstky. Obvykle na povrchu proteinů. Šest hydrofilních neutrálních aminokyselin Serine Threonine Tyrosine Asparagine Glutamine Cysteine Ser, S Thr, T Tyr, Y Asn, N Gln, Q Cys, C

Tři basické aminokyseliny Dvě kyselé aminokyseliny Tvoří vodíkové můstky. Obsahují ionizovatelné skupiny. Tři basické aminokyseliny Dvě kyselé aminokyseliny Aspartate Glutamate Asp, D Glu, E Lysine Arginine Histidine Lys, K Arg, R His, H

Histidin pK cca 6 při fysiologickém pH imidazolový kruh může fungovat jako donor i akceptor protonů Imidazolový kruh zároveň působí jako nukleofil Histidin se vyskytuje v aktivním místě velké řady enzymů

Devět hydrofobních aminokyselin Netvoří vodíkové můstky Ponořeny v proteinech Netvoří vodíkové můstky Glycine, Gly, G Alanine, Ala, A Valine, Val, V Leucine, Leu, L Isoleucine, Ile, I Netvoří vodíkové můstky Methionine, Met, M Phenylalanine, Phe, F Tryptophan, Trp, W Proline, Pro, P (imino kyselina)

Tvorba peptidové vazby Peptidová vazba spojuje aminokyseliny vede ke vzniku proteinů Polypeptidický řetězec vždy začíná na N-konci (aminokyselinový zbytek č. 1; volná NH3+ skupina je nalevo) a končí na C-konci (volná COO- skupina napravo).

Peptidická vazba je rigidní Mezi sousedními postranními řetězci jsou tři vazby. Jedna z vazeb vykazuje částečně násobný charakter a nemůže rotovat - je rigidní. Ostatní dvě vazby mohou rotovat. Tyto skutečnosti umožňují vznik sekundárních struktur (a-helix, b-struktury).

Čtyři úrovně struktury bílkovin Primární struktura (chemická): pořadí aminokyselin v řetězci, další detaily (umístění disulfidických můstků, prosthetických skupin, glykosylace). Sekundární struktura: vzájemný prostorový vztah sousedních nebo blízkých aminokyselin. Typické struktury: a-helix, b-struktura. Stabilizace pouze vodíkovými můstky. Terciární struktura: vzájemný prostorový vztah vzdálených částí řetězce. Stabilisace vodíkovými můstky, iontovými interakcemi, hydrofobními interakcemi a disulfidickými můstky. Kvartérní struktura: prostorové uspořádání molekulových podjednotek, které tvoří celistvé molekuly (např: 2 a a 2 b řetězce hemoglobinu)

Bílkoviny: a- helix Vlastnosti: (1) „Tyčkovitý“ tvar, postranní řetězce směřují ven (2) Všechny C=O a N-H skupiny z peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky (3) Vodíkové můstky jsou rovnoběžné s osou helixu (4) 3.6 aminokyselinového zbytku na jednu otočku (5) Pravotočivý směr díky přítomnosti L-aminokyselin

Bílkoviny: α-helix

Bílkoviny: β-struktury Maximálně „natažený“ proteinový řetězec. Vlastnosti: (1) Řetězec je natažen, postranní řetězce směřují střídavě nahoru a dolů (2) Všechny C=O & N-H skupiny z peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky (3) Vodíkové můstky se vytváří mezi jednotlivými řetězci a jsou kolmé na řetězce (4) Paralelní struktury: N-konce jsou na téže straně (5) Antiparalelní struktury: N-konce jsou na opačných stranách

Bílkoviny: β-struktury

Bílkoviny: β-struktury

Supersekundární struktura

Intramolekulární vazby

Terciární struktura - myoglobin

Kvartérní struktura glutaminsynthetasa 12 podjednotek

Aminokyselinové složení proteinů Úplná hydrolýza proteinu (6 M HCl, 110 °C, 20 – 72 hod.) Dělení aminokyselin ionexovou chromatografií HPLC na reverzních fázích Fotometrická detekce po reakci AK s ninhydrinem Automatické analyzátory aminokyselin

Počet polypeptidických řetězců Stanovení počtu N- a C- koncových aminokyselin Značení α-amino skupiny (např. 2,4-dinitrofluorbenzenem)  hydrolýza proteinu  detekce značených aminokyselin Odštěpení aminokyselin z C-konce karboxypeptidasou Podmínka: řetězce mají různé koncové aminokyseliny!

Určení N-koncové aminokyseliny

Přerušení disulfidických můstků Tvořeny cysteinem Uvolnění jednotlivých řetězců Oxidace kyselinou permravenčí na kys. cysteovou

Přerušení disulfidických můstků Redukce merkaptoethanolem a následující karboxymethylace kyselinou jodoctovou karboxymethylcystein

Stanovení primární struktury Postupné odbourávání od N-konce Edmanův postup Použití fenylisothiokyanátu Možno analysovat peptidy do 60 - 70 aminokyselin

Edmanovo odbourávání

Štěpení dlouhých řetězců Specifické proteasy (trypsin, chymotrypsin, pepsin, thermolysin...) Chemické štěpení (bromkyan štěpí za methioninem) Následná separace štěpů chromatografickými a elektroforetickými metodami Nutná dvě nezávislá štěpení (metoda překrývajících se štěpů)

Kdo byl první??? Ribonukleasa (1960) F. Sanger – Nobelova cena