Biochemie I Aminokyseliny a peptidy

Prezentace na téma: "Biochemie I Aminokyseliny a peptidy"— Transkript prezentace:

1 Biochemie I Aminokyseliny a peptidy

2 Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce)

3 AMINOKYSELINY Když se řekne AK
( -COOH, -NH2 nebo -NH-) prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny: - (=2-), -(=3-)..... -(= poslední) -alanin: +H3N-CH2-CH2-COO- -aminobutyrát (GABA): +H3N-CH2-CH2-CH2-COO-

4 -aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera)
COO COO-   D: H CNH L: NH3+ CH   R R Kódované aminokyseliny (20):  -aminokyseliny (kromě prolinu – NH2 skupina zabudována do cyklu)). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který nese karboxylovou skupinu.

5 AMINOKYSELINY L--aminokyseliny: kódované (= proteinogenní, viz dále)
nekódované: - odvozené od kódovaných aminokyselin -Tyrkatecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...) -vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace) - metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin)

6 Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Glycin Gly N Alanin Ala Valin Val E Leucin Leu

7 Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Isoleucin Ile N E Prolin Pro Fenylalanin Phe Tyrosin Tyr P Tryptofan Trp

8 Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Histidin His Z N Serin Ser P Threonin Thr E Cystein Cys Methionin Met

9 Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Lysin Lys Z E Arginin Arg N Asparagová kyselina Asp K Glutamová kyselina Glu Asparagin Asn P Glutamin Gln

10 Naučit se AK včetně označení hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci

11 Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců
Funkční skupiny: Alifatické Aromatické Hydroxylové Sulfhydrylové Kyselé Basické Polární Nepolární

12 Hydrofobní aminokyseliny

13 Polární aminokyseliny

14 Kyselé aminokyseliny

15 Bazické aminokyseliny

16 Větvené aminokyseliny
leucin, valin, izoleucin energetické substráty nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata) součástí specializovaných roztoků aminokyselin

17 Kódované aminokyseliny:
Jednopísmenkové zkratky Proč jsou v tabulce vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v pH 7 = 2) volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v pH 7 = 0)

18 Úvod do teorie elektrolytické disociace:
kyselina: HA  H+ + A- např CH3-COOH  H+ + CH3-COO- termodynamická disociační konstanta zdánlivá přičemž

19 Úvod do teorie elektrolytické disociace:
báze: B + H2O  BH+ + OH- např: CH3-NH2 + H2O  CH3-NH3+ + OH- bazická zdánlivá disociační konstanta: ale: Kw = [H+] . [OH-] a tedy: po spojení: [H2O] zahrnu do konstanty a vypočtu 1/KB: Kyselá disociační konstanta KA ionisované formy báze B (např. CH3-NH3+) je tedy rovna:

20 KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pKA SKUPIN VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH
-COOH ,-COOH imidazolium -SH -NH3+ fenol -NH3+ guanidinium 2,5 4, , , , , , ,5

21 Hodnoty pKA disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 oC)
-karboxylová C-koncová 1,7 - 2,6 1,8 - 3,6 imidazolová His 6,0 5,6 - 7,0 -aminová Lys 10,53 9,4 - 11,0 sulfhydrylová Cys 8,33 8,3 - 8,6 Funkční skupina Aminokyselina Hodnoty pKA nalezené ve volných aminokyselinách Hodnoty pKA nalezené v bílkovinách ,-karboxylová Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0 - 4,7 -aminová N-koncová 8,8 - 10,7 7,9 - 10,6 fenolová Tyr 10,07 9,8 - 10,8 guanidylová Arg 12,48 11,6 - 12,6

22 TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN
Mám roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit pH, když budu přidávat NaOH? Na začátku: jen HA, množství A- odpovídá množství přidaného louhu. převedeme na pH: (Hendersonova - Hasselbalchova rovnice)

23 TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN

24 Titrační křivka glycinu

25

26 Cystin = cystinylcystein

27 Titrační křivka cystindihydrochloridu

28 ISOELEKTRICKÝ BOD DEFINICE: pH, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr); označujeme pI Isoionický bod: pH, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový.

29 ISOELEKTRICKÝ BOD př.: Gly (titruji Gly.HCl) KA1 KA2
Z = +1 (Gly1+) (Gly) (Gly-1) Ale v pH = pI platí: [Gly1+] = [Gly-1] takže:

30 Isoelektrické body kódovaných aminokyselin
Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pI (nutno načrtnout titrační křivku) Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pKA v okolí pI) Isoelektrické body kódovaných aminokyselin AK pI Gly 6,0 Ser 5,7 Phe 5,5 His 7,6 Ala Thr 5,6 Tyr Lys 9,6 Val Cys 5,0 Trp 5,9 Arg 10,8 Leu Met Asn 5,4 Asp 3,0 Ile Pro 6,4 Gln Glu 3,2

31 OPTICKÉ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1 mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm. Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace)

32 Chemické reakce AK Stanovení AK (reakce aminoskupin): ninhydrin, Sangerovo činidlo, dansylchlorid

33 Chemické reakce AK Reakce postranních řetězců: modifikační reakce - různá specifita např. značení bílkovin radioaktivním jodem blokování SH skupin (proti oxidaci a vzniku disulfidových můstků)

34 Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby
Chemické reakce AK Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby

35 Chemické reakce AK

36 Chemické reakce AK

37 Nomenklatura peptidů N- konec (začátek), C-konec (konec)
acylaminokyseliny, např. Gly.Ala.His = glycylalanylhistidin Pozor: Ala.Tyr  Tyr.Ala

38 PŘIROZENÉ PEPTIDY Zvláštnosti struktury:
·     nekódované aminokyseliny (ornithin, -alanin ...) ·     často i D-aminokyseliny ·     někdy i tzv. -peptidové vazby (Glu) ·     cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby) ·     větvené struktury blokování konců (pyroglutamát, glycinamid)

39 Biosynthesa meziprodukty odbourávání bílkovinných prekursorů
synthesa pomocí speciálních enzymových reakcí (ne na ribosomech cestou protheosynthesy)

40 Skupiny přirozených peptidů
·     di a tripeptidy (glutathation, umělý aspartám...) ·     peptidové hormony (oxytocin, vasopresin....přechod k proteohormonům) ·     neuromodulátory: enkefaliny (pentapeptidy), endorfiny ( AK) ·     peptidová antibiotika (mnoho nekódovaných AK) ·     peptidové zoo- a fytotoxiny (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny: Amanita phalloides) ·     protaminy (malé bazické lineární peptidy, mlíčí ryb) polyaminokyseliny (buněčné stěny bakterií: poly--L-Glu, poly--D-Glu)

41 Skupiny přirozených peptidů

42 URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ
AK1-AK2-AK3 ....AKn  kyselá nebo bazická hydrolysa  AK1 + AK2 + AK AKn (určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny - chromatografické dělení)

43 URČOVÁNÍ SEKVENCE AMINOKYSELIN
V ŘETĚZCI Edmanovo odbourávání

44 N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY
URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY Sangerova reakce

45 N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY
URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY Edmanovo odbourávání

46 SYNTHESA PEPTIDŮ in vitro
a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy, karbodiimidová synthesa) b) blokování skupin, které nemají reagovat c) synthesa peptidové vazby d) odblokování

47 Chromatografické metody pro separaci proteinů
Gelová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie

48 Ionexová chromatografie
Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! Celulosové a dextranové ionexy

49 Ionexy Katexy – záporný náboj  vazba kationtů
silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO- Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

50 Ionexová chromatografie proteinů
Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii

51 Ionexová chromatografie
Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

52 Typická ionexová chromatografie
Loading ends, Low salt wash begins Salt gradient Protein absorbance II III Salt gradient ends Salt gradient begins Peak of unbound protein Loading starts I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins

53

54 Příklad 1 Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pI = 2,98), glycin (pI = 5,97), threonin (pI = 6,53) a lysin (pI = 9,74) v citrátovém pufru pH 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex-50 (katex). V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?

55 Příklad 2 Na sloupec DEAE-celulosy (anex) byl nanesen vzorek obsahující sérový albumin, ureasu a chymotrypsinogen (isoelektrické body pI jsou 4,9; 5,4 a 9,5) v pufru pH 7,0. V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?