Laboratorní diagnostika chlamydiových infekcí a její interpretace Naděžda Sojková a kol. Zdravotní ústav se sídlem v Praze Oddělení virologie

Chlamydie Unikátní biologické vlastnosti : nitrobuněční „energetičtí parazité“ bez schopnosti syntetizovat ATP Struktura podobná G- bakteriím, ale liší se: nemají ve stěně k. muramovou mají více lipidů rigidní buněčná stěna LPS méně toxický a imunologicky méně účinný při indukci zánětu

Růstový cyklus I. Optimální růstové podmínky infekční elementární tělísko (EB, 250-400 nm) vstup do buněčného fagosomu inhibice fagolysosomální funkce EB se zvětší a transformují v metabolicky aktivní : neinfekční retikulární tělísko (RB, 800-1000 nm) binární dělení ( po 16-24 hod) spotřeba ATP hostitelské b. a kondenzace opět v EB za 48-72 hod je cytoplasma naplněna EB a praská (popř.exocytóza) výsev infekčních částic

II. Zhoršené růstové podmínky (Chybná strategie léčby, produkce prozánětlivých cytokinů- IFNgama) Přerušení vývojového cyklu vznik aberantních tělísek s alterovanou expresí genů zejména cHSP- exprimován na úkor MOMP, OMP.. vznik chronických (perzistentních) infekcí (deregulace imunity - fibroproduktivní zánět, reaktivita pacienta- genetika) EB z chronicky infikovaných buněk se uvolňují exocytózou

Klasifikace a klinické projevy Chlamydiacae – 2 rody: Chlamydia Chlamydia trachomatis (1907) – 18 sérotypů Urogenitální trakt: lymfogr. venereum (L1-3), negonokoková urethritis, epididymitis, cervicitis, endometritis, salpingitis, periadnexitis (D-K) Oko: trachom , inkluzní konjunktivitis (A-C) Neonatální infekce: konjunktivitida, otitida, pneumonie Projevy chronické infekce: chronický urogenitální zánět, poruchy reprodukce, akutní perihepatitida, chronická proktitida, chlamydiová a postchlamydiová reaktivní artritida, Reiterův syndrom Klasifikace a klinické projevy

Chlamydophila (od r. 1999) Chlamydophila pneumoniae (1965): 50-80% promořenost dospělé populace Akutní infekce: nejčastěji HCD pneumonie, bronchitida, sinusitida ale také konjunktivitida běžné jsou reinfekce (uplatňuje se spíše sekreční imunita) Komplikace akutní infekce: infekční nebo reaktivní artritida meningoencefalitida endokarditis, myokarditis, perikarditis syndrom Guillain-Barré

Perzistentní infekce: vztah k etiologii astma bronchiale, CHOPN, arterioskleróze, aortálním aneurysmatům Projevy chronické infekce: exacerbace astma bronchiale, chron. obstr. bronchitida, reaktivní artritida Studován vztah k: arterioskleróze bronchopulmonálnímu karcinomu onemocněním CNS včetně indukce RS

Chlamydophila psittaci: Antropozoonóza - „ornitóza“ (obecně) - „psitakóza“ (papouščí nemoc) nositelem infekce jsou ptáci (holubi, papoušci) ale také savci ( koně, ovce, skot , kočky) u člověka se nákaza vyskytuje sporadicky atypická pneumonie, myokarditida, hepatitida, hepatosplenomegalie

Základní zásady terapie chlamydiových nákaz: Chlamydie – nejvyšší citlivost k makrolidům a tetracyklinům. Podmínky: co nejnižší MIC vysoký průnik do tkání (prostřednictvím makrofágů do místa zánětu) dosažení účinných hladin v endosomu dlouhodobé působení (2-3 týdny) Vše optimálně splňuje Doxycyclin a Azithromycin (Sumamed, Zetamac) Kombinace s metronidazolovými preparáty-Entizol Podpůrná enzymoterapie

Důležité chlamydiové antigeny Major outer membrane protein, MOMP: druhově specifický antigen na povrchu EB Lipopolysacharid, LPS: rodově specifický , tj společný všem druhům Ch. působí prozánětlivě jako polyklonální aktivátor makrofágů a lymfocytů Chlamydiový heat-shock protein, c-HSP: fylogeneticky konzervovaný prozánětlivý protein indukce protrahované DTH schopnost navození autoimunitních procesů

Laboratorní diagnostika Jak? Antigen? Materiál? Přímá hybridizace DNA výtěry, BAL, punktát PCR moč, likvor, biopsie, etc. DIF MOMP, LPS 2. Nepřímá KFR ELISA LPS (genus), MOMP,HSP krev MIF MOMP (EB-species) immunoblot MOMP,OMP2,TARP CPAF, HSP60, YwbM

Diagnostické metody, testy: 1. genus–specifický test : Anti-Chlamydia IgG, IgM and IgA - LPS antigen – LPS-ELISA 2. MIF SeroFia - species–specifický test : Anti-Chlamydophila pneumoniae (CP) a psittaci CPs , Chlamydia trachomatis (CT) IgG, IgM a IgA protilátky proti MOMP EB - MIF metoda. 3. recomLine Chlamydia IgG, IgA a IgM test.

Přínos metody recomLine vysoká specificita pro všechny 3 druhy chlamydií species specifické antigeny CPAF-faktor virulence, TARP-vazba actinu a YwbM pro CP HSP60 indikátor chronických infekcí vyšší senzitivita IgA protilátek, zejména u CP a CPs jediná vysoce specifická metodika pro sérologii CPs vedle IgG a IgA další třída protilátek IgM možnost automatizace současné použití jak pro screening , tak pro konfirmaci výsledků jednokroková diagnostika všech 3 druhů chlamydií rekombinantní antigeny vylučují zkříženou reaktivitu

New recomLine Chlamydia - examples of positive sera- C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci MOMP OMP2 TARP CPAF HSP60 MOMP OMP2 TARP CPAF YWBM MOMP OMP2 TARP CPAF A IgG C. trachomatis infection: IgG, IgA and IgM positive; IgM IgA B IgG C. pneumoniae infection: IgG, IgA and IgM positive IgM IgA C IgG C. psittaci infection confirmed by the MOMP reactivity in IgA and IgM; additional past infections with C. trachomatis and C. pneumoniae IgM IgA

New recomLine Chlamydia Chlamydia trachomatis positive sera C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci MOMP OMP2 TARP CPAF HSP60 MOMP OMP2 TARP CPAF YWBM MOMP OMP2 TARP CPAF A IgG typical past C. trachomatis infection with slight cross-reactivity to C. pneumoniae and C. psittaci IgM IgA B IgG double infection with C. trachomatis and C. pneumoniae verified by TARP (C. trachomatis) and CPAF and YWBM (C. pneumoniae); IgA positive IgM IgA C IgG C. trachomatis infection; might be a recent infection due to positive IgM IgM IgA

New recomLine Chlamydia Chlamydia pneumoniae positive sera C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci MOMP OMP2 TARP CPAF HSP60 MOMP OMP2 TARP CPAF YWBM MOMP OMP2 TARP CPAF A IgG typical C. pneumoniae infection; IgA positive IgM IgA B IgG typical C. pneumoniae infection; might be a recent infection due to positive IgM IgM IgA C IgG double infection with C. pneumoniae and C. trachomatis verified by YwbM (C. pneumoniae) and TARP and CPAF (C. trachomatis) IgM IgA

New recomLine Chlamydia Chlamydia psittaci positive sera C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci MOMP OMP2 TARP CPAF HSP60 MOMP OMP2 TARP CPAF YWBM MOMP OMP2 TARP CPAF A IgG C. psittaci infection confirmed by the MOMP reactivity in IgA; additional past infections with C. trachomatis and/or C. pneumoniae IgM IgA B IgG acute infection with C. psittaci proven by MOMP IgM; past infection with C. pneumoniae that (TARP, CPAF and YwbM) IgM IgA C IgG no C. psittaci infection (as has been determined by MIF); past infections with C. trachomatis and C. pneumoniae IgM IgA

Interpretace sérologických nálezů 1.Přítomnost protilátek anti LPS – rozdělení do infekčních stadií: Pouze IgM popř. IgA – v.s. akutní infekce-primoinfekce/reinfekce pouze IgG (+/++) – anamnestická odpověď IgG (+++) a IgA (+/++) – recentní , v.s. aktivní infekce 2. Potvrzení/vyloučení aktivní infekce – stanovení anti MOMP: Species-specifický test-MIF: titr IgG 1:512 a vyšší-známka aktivní infekce Titr IgA 1:64 – potvrzení aktivní infekce Sporné nálezy – konfirmace immunoblotem 3. IgG anti-cHSP60 protilátky: v.s. chronická infekce, potvrzení opakovaným vyšetřením, popř. immunoblotem

Výsledky Porovnání infekčních stádií u pacientů s MS a v CG – Elisa, MIF

p = 0,003; ODR = 11,25 p = 0,61; ODR = 0,89

Závěr Pro rychlou a přesnou diagnostiku akutních infekcí má větší význam přímý průkaz patogena ve vhodně voleném materiálu. Pro screeningové vyšetření je vhodná sérologie založená na protilátkové odpovědi anti-LPS. 3. Průkaz protilátek proti MOMP je významně důležitějším markerem v diagnostice chronických aktivních chlamydiových infekcí než protilátky proti LPS. 4. IgG anti cHSP60 jsou významným markerem pro potvrzení a sledování perzistentní infekce. 5. Dokladem neustálého zpřesňování diagnostiky je nový test recomLine s rekombinantními antigeny TARP, CPAF a YWBM. 6. Výsledky naší spolupráce s klinickými pracovišti potvrzují, že stavům chronické a perzistentní infekce lze předcházet systematickým vyšetřováním, které společně s klinickým stavem pacienta pomáhá lékaři stanovit správnou diagnózu a léčbu akutních infekcí.