Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům

Úvod Etiopatogeneticky je zásadní role při vzniku diabetu 1.typu (T1D) připisována autoreaktivním T lymfocytům (polarizace ve směru Th1).

Úvod - pokračování prediabetes záchyt protilátek manifestace diabetu t Makrofágy, Tc CYTOKINY T-lymf B-lymf ICA, GAD65A, IAA, IA2A CYTOKINY  buňka  buňka

Co dělat? Vyléčit – neumíme, léčit – umíme, ALE… Zabránit vzniku – neumíme, ALE… nicméně v každém případě musí být opatření cílená na prevenci realizována nejpozději ve fázi prediabetu…proto také predikce

Program predikce diabetu 1.typu Určení (ne)přítomnosti rizikových alel diabetogenních genů (HLA molekuly II.třídy), cca 40%genetické vnímavosti k T1D  určení celoživotního rizika pro vznik T1D Protilátky proti GAD65, IA2  určení středně-krátkodobého rizika pro vznik T1D

Kategorie genetického rizika DM 1 u prvostupňových příbuzných českých diabetických dětí Cinek O.

Co ale ty T lymfocyty?

Problém detekce autoreaktivních lymfocytů četnost autoreaktivních T-lymfocytů v periferní krvi - 1-10 buněk / 1 mil

The Immunology of Diabetes Society www.idsoc.org

Název projektu: DETEKCE ANTI-INZULÁRNÍ T BUNĚČNÉ ODPOVĚDI U PACIENTŮ S DIABETEM 1.TYPU A U JEJICH PRVOSTUPŇOVÝCH PŘÍBUZNÝCH Číslo projektu: NR 8127-3 Doba řešení: 1.1.2004 – 31.12.2006 Poskytovatel: IGA MZ ČR Hlavní řešitel: MUDr.Kateřina Štechová, PhD., Laboratoř autoimunitních onemocnění Pediatrické kliniky UK 2.LF, Praha Spoluřešitel: Doc.MUDr.František Saudek, DrSc., Klinika diabetologie Centra diabetologie IKEM, Praha

Anotované cíle projektu Hlavní cíl: Zavést a standardizovat laboratorní metodu umožňující sledovat přítomnost a intenzitu T buněčné odpovědi zaměřené proti nejdůležitějším známým diabetogenním autoantigenům. Cílem bylo zlepšení diagnostiky osob potenciálně ohrožených vznikem diabetu (z okruhu prvostupňových příbuzných pacientů) a zlepšení sledování efektu imunointervenčních postupů. Vedlejší cíl: Ověřit, zda by popsaná metoda byla využitelná i v dalších aplikacích: Sledování průběhu (stavu T buněčné imunity) po transplantaci pankreatu (včetně event. transplantace ostrůvků) V diagnostice autoimunitního procesu u dospělých pacientů s diabetem 1.typu (LADA diabetes) Hypotéza: cytokinová diagnostika umožní zachytit patologickou Th1 odpověď vůči diabetogenním autoantigenům (IFN-gamma x IL-4)

2003 Proliferační test aktivace T lymfocytů intracelulární stanovení cytokinů + stanovení povrchových markerů T lymfocytů FACS stanovení aktivačních markerů tetramerová analýza ELISPOT, ELISA

Uspořádání studie cytokinů z kult.supernatantu Čerstvě izol. PBMNC + autoantigeny Autoprotilátky, C peptid, HLA typ. Klin.a anamn.data Inkubace a pak protein microarray analýza cytokinů z kult.supernatantu (+ ELISPOT a ELISA) Reakce? Typ a intenzita.

(Auto)antigeny GAD 65 GAD a.a. 247-279 509-528 524-543 IA-2/R2 a.a.853-872 Proinsulin, B ř. a.a.9-23 (Hsp277 a.a.277-300) PHA jako pozitivní kontrola IDS

Také ELISPOT +IL-4 Také ELISA Pos Neg GCSF GM-CSF GRO GRO -alfa IL-1alfa IL-2 IL-3 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10 IL-13 IL-15 IFN-gamma MCP-1 MCP-2 MCP-3 MIG RANTES TGF-beta1 TNF-alfa TNF-beta blank Také ELISA

Soubor Skupina Plánovaný počet vyšetření na celou dobu řešení projektu Počet osob, které vstoupily do projektu Finálně statisticky hodnocení recentní záchyt diabetu 60 112 Příbuzní 207 (rodiče 116, sourozenci 91) 60 bez autoprotil. +10 s protilátkami zdravé kontroly 45 73 transplantovaní 15 10

Vstupní kritéria žádné další přidružené autoimunitní choroby (kromě diabetu) nebo imunopatie náběr mezi 8. a 9. hodinou ráno nepřítomnost jakýchkoliv známek infekčního onemocnění nepřítomnost větší fyzické zátěže 24h před odběrem krve v případě pacientů s čerstvou manifestací diabetu byl náběr proveden 7 dní od stanovení diagnózy za předpokladu normalizace parametrů vnitřního prostředí (ionty, parametry acidobazické rovnováhy) a za předpokladu, že klinik nehodnotil diabetickou ketoacidózu při záchytu choroby jako těžkou (pH≤7,1). U pacientů s diabetem byl náběr proveden při glykémii v rozmezí 4-10 mmol/l.

Statistická analýza Jelikož data nevykazovala normální rozložení, byly pro analýzu užity neparametrické metody. V rámci statistického vyhodnocení bylo v první fázi byla ověřována hypotéza, zda existuje vliv příslušnosti vyšetřované osoby k určité skupiny na produkci cytokinů a chemokinů v organismu. Hodnocení bylo provedeno Kruskal Wallisovým testem. Hladina významnosti byla zvolena α=0,05. Pokud byla nalezen statisticky významný rozdíl mezi všemi čtyřmi skupinami, bylo přistoupeno k mnohonásobnému porovnání (jednotlivé skupiny mezi sebou). Mnohonásobné porovnání bylo provedeno Mann – Whitney U testem s následnou korekcí hladiny významnosti – za signifikantní byly považovány hodnoty p<0,05/6, tj. p<0,0083. Pro proměnné, které statisticky významně odlišují porovnávané skupiny, bylo snahou nalézt také hladinu, na které jsou skupiny nejlépe odlišeny. Pro nalezení takového bodu byly použity ROC křivky.

Výsledky Produkce cytokinů a chemokinů se mezi sledovanými skupinami lišila a to jak bazální – tak i po specifické stimulaci. Naprosto se svými výsledky vydělila skupina prvostupňových příbuzných s pozitivní alespoň jednou autoprotilátkou, tedy skupina, kterou je z hlediska brzkého vzniku diabetu 1.typu riziková.

Mann-Whitney U test (exact p-hodnota) P-hodnota pro ROC křivku DRL+vs DV Cytokin (chemokin) Mann-Whitney U test (exact p-hodnota) Sensitivita Specificita Plocha pod křivkou P-hodnota pro ROC křivku GCSF p=0,001 0,833 1,0 0,944 p=0,006 GM-CSF 0,889 0,75 0,8958 p=0,015 IL-1 alfa p=0,003 0,9583 p=0,005 IL-2 0,61 IL-3 p<0,001 0,972 p=0,004 IL-5 0,778 0,9514 IL-7 p=0,002 0,8819 p=0,019 IL-13 MIG p=0,017 TGF beta 0,667 0,8403 p=0,037 TNF alfa

ROC křivka pro IL-5 DV vs DRL+

IL-5 a IL-13 %intenzity %intenzity p0,001 (oba) p0,001 p=0,002

IL-5 a IL-13 korelace D DV DRL DRL(HR) IL-5 IL-3 (r=0,883), a IL-6 (r=0,803) IL-1alpha (r=0,880) IL-10 (r=0,879), MCP-1 (r=0,846), TNF-alpha (r=0,823) IL-8 (r=0,941) IL-13 IL-1alpha (r=0,931), TNF-beta (r=0,873) a IL-7 (r= 0,846)

IFN-gamma P=0,006 P=0,003 P=0,006 %intenzity spotu

Změna reaktivity po specifické stimulaci jednotlivými autoantigeny Po stimulaci směsí diabetogenních autoantigenů byly zjištěny následující statisticky signifikantní rozdíly (pozn.byl použit Wilcoxonův párový neparametrický test, kdy za signifikantní je považováno p0,05: u pacientů s diabetem byl významný pokles v produkci IL-3 (p=0,008) a IL-15 (p=0,038). U příbuzných bez protilátek byl signifikantní pokles IL-1 (p=0,013) a MCP-2 (p=0,045). U příbuzných s protilátkami byl pozorován signifikantní nárůst produkce IL-6 (p=0,043). Ve skupině zdravých kontrol nebyly pozorovány statisticky signifikantní rozdíly mezi bazální produkcí a produkcí po stimulaci autoantigeny.

Odpověď na stimulaci jednotlivými autoantigeny uváděny průměrné hodnoty pro TNF-beta v pg/ml Skupina NK GAD65-1 GAD65-2 GAD65-3 GAD65 IA2 peptid PI peptid Směs autoag D 100 170 201 166 150 143 121 140 DV 174 165 171 175 153 173 DRL 21 60 53 73 33 124 65 DRLHR 26 139 235 154 179 107 126

Rozdílná reaktivita proti jednotlivým autoantigenům u příbuzného s pozitivními autoprotilátkami stanovená metodou ELISA IFN gamma (pg/ml) TNF beta IL4 IL6 IL10 bazální produkce 9 15 78 199 produkce stimulovaná směsí autoantigenů 2 114 50 GAD65-1 4 80 8 91 GAD65-2 6 303 HIGH 586 GAD65-3 1 79 28 184 Celá molekula GAD65 12 150 201 proinzulín 83 26 223 tyrozinfosfatáza IA2 3 160 53

Závěr – část 1 Pro sledování reaktivity vůči diabetogenním autoantigenům bychom doporučovali na základě našich výsledků vyšetřovat zejména produkci TNF-beta, IL-10 a IL-6 (metodou ELISA resp. ELISPOT). Pro obecné posouzení chování imunitního systému člověka ohroženého vznikem diabetu bychom doporučili například pomocí proteinové microarray doplnit ještě následující panel cytokinů a chemokinů: IL-2, (IFN-gamma), IL-5,-13, TGF-beta1, GCSF, IL-1alpha, TNF-alpha, IL-15, MCP-2 a MIG. Posuzování specifické reaktivity je jednoznačně vhodnější pomocí jednotlivých autoantigenů než pomocí jejich směsi, i když to klade větší nároky na pracnost. Test musí být proveden za jasně specifikovaných podmínek.

Srovnání jednotlivých metod cytokinové a chemokinové detekce Největší přednost(i) Největší zápor(y) Proveditelnost Dostupnost kitů (v ČR) Proteinová micrroarray Simultánní detekce mnoha parametrů, ideální screeningová metoda U některých látek vyšší detekční limit, metoda není kvantitativní Není obtížná, Pro záznam výsledku nutný scanner nebo digitální fotoaparát a program analýzy obrazu. Dobrá, spektrum nabízejících firem je ale úzké ELISPOT Detekce na úrovni jedné buňky Pracnost, každý cytokin nutno analyzovat zvlášť (s duálními kity nakonec nebyla dobrá zkušenost) Z uvedených metod subjektivně nejpracnější, poněkud problémy s analýzou (nutný alespoň nějaký program analýzy obrazu, ideálně ELISPOT reader, ale je drahý) Špatná, ale dobrá v rámci EU ELISA Kvantitativní výsledek v konkrétní koncentraci Každý cytokin nutno analyzovat zvlášť nutný ELISA reader, ten je ale většinou běžně dostupný Široká nabídka od mnoha firem

Další výstupy projektu Reaktivita PBMC na polyklonální aktivátor (PHA) Vliv dalších faktorů na produkci cytokinů a chemokinů posuzovaný pomocí proteinové microarray Pohlaví Genetické riziko Věk Pozitivita autoprotilátek, C peptid, FPIR Denní doba (Ráno vs odpoledne) Pohybová zátěž Vliv stavu metabolismu a glykémie na výsledek Reaktivita čerstvě izolovaných PBMC vs kryoprezervovaných Změna reaktivity v čase Transplantovaní

Děkuji za pozornost 