Analýza proteinů SDS PAGE elektroforézou
http://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4&feature=fvwrel http://www.youtube.com/watch?v=pnBZeL8nFEo
Molekulárně biologická diagnostika Diagnostika na úrovni DNA, RNA a proteinů Analýza genomu, transkriptomu, proteomu, příp. metabolomu Analýza kvalitativní i kvantitativní
Studium přítomnosti proteinů v buňkách (analýza proteomu) Metody pro stanovení fyzické přítomnosti proteinů: polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) westernový přenos imunoprecipitace imunohistochemie izoelektrická fokusace dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu chromatografie fluorescenční a elektronová mikroskopie průtoková cytometrie
Nejpoužívanější techniky - proteiny Elektroforéza 1D 2D ELISA Rentgenová krystalografie NMR Hmotnostní spektroskopie Chromatografie (HPLC)
SDS-PAGE (= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) -metoda pro separaci proteinů dle jejich velikosti
Proč používat akrylamidový gel k separaci proteinů? Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix Ideální pro separaci proteinů Menší velikost pórů než u agarosy Proteiny jsou menší než intaktní chromoz. DNA Gel je vytvořen polymerací akrylamidu a N´,N´-methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného.
Molekulová hmotnost proteinů velikost měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kDa) Dalton = jednotka atomové hmotnosti = přibližně se rovná hmotnosti (1,66 x 10 -27 g) Průměrná aminokyselina = 110 Da Průměrný nukleotidový pár = 649 Da
Akrylamidový gel akrylamid N,N‘ - methylenbisakrylamid
Akrylamidový gel Zdroj volných radikálů APS amonium persulfát (NH4)2S2O8 (peroxodisíran amonný) CAS 7727-54-0 Katalyzátor TEMED N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiamin CAS 110-18-9
Akrylamidový gel
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) CH2 CH3 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový detergent solubilizuje a denaturuje proteiny dodává proteinům negativní náboj Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu Zvýšená teplota denaturuje proteiny SDS
-proteiny jsou tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura -denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti
Separace proteinů v akrylamidovém gelu
Příprava gelu
Jednotlivé kroky experimentu. Příprava polyakrylamidových gelů Jednotlivé kroky experimentu *Příprava polyakrylamidových gelů *Příprava vzorků pro SDS-PAGE *Povaření vzorků při 95C po dobu 4 min. *Aplikace vzorků na gel *Vlastní elektroforesa probíhá při konstantním napětí *Barvení gelu pomocí Coomassie Blue vs blotting *Odbarvení gelu MetOH/HOAc
Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE. Tris pufr utváří vhodné pH Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE? *Tris pufr utváří vhodné pH *DTT (100mM) *SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent poskytující proteinům negativní náboj *Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení *“Bromophenol Blue“ barvivo umožňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu)
Praktické zhotovení gelu Připravíme ELFO skla Složíme elektroforetické komůrky pro nalití gelů Připravíme základní roztok pro dělicí gel, přidáme k němu TEMED a APS pro zahájení polymerace Naneseme gel do elektroforetické komůrky, zarovnáme hladinu redestilovanou vodou a necháme tuhnout (min. 45 min). Připravíme roztok pro zaostřovací gel, přidáme k němu TEMED a APS Nanášíme jej do elfo komůrky na povrch dělicího gelu a vsadíme hřeben pro vytvoření jamek a necháme jej tuhnout (min. 45 min) Odstraníme hřeben, uvolníme elfo komůrky s gelem
Do elektroforetické nádoby nalejeme elfo pufr Stojan s elfo komůrkami s připravenými gely vložíme do elfo nádoby, doplníme elektroforetický pufr Naneseme vzorky (před nanášením se musí povařit se vzorkovým pufrem při 90-100C po dobu 5 min) Doplníme elfo pufr a zapneme zdroj (80V po 0,5-1hod, 120 V po 1-1,5 hod) Ukončení elektroforézy po doběhnutí elfo barviva na konec dělicího gelu Rozděláme elfo komůrky, vyndáme gely a: - barvíme - přeneseme proteiny na nitrocelulózovou membránu a blotujeme…
SDS-PAGE standardy Protein Kalibrované MW v Tris-HCl gelu Myosin 201,179 -galactosidáza 120,284 Bovinní sérový albumin 100,236 Ovalbumin 55,925 Anhydráza 38,289 Soyben trypsin inhibitor 29,678 Lysozym 20,669 Aprotinin 6,969
Denaturované vzorky jsou naneseny na gel
Podmínky pro elektroforézu: 15 min, 100 V 1 – 1,5 hod 150 V
Princip dělení, Laemliho pufrový systém Různé pH „stacking“ a „resolving“ gelu Tris-Cl pufr, glycinový running pufr
Iontové složky Laemliho systému Glycin → nižší pohyblivost než Cl- ionty Ohmův zákon V=I*R Stejné I → ↑ V ↑ odpor v Gly oblasti SDS-proteiny - mobilita mezi Gly - Cl-, „chyceny“ a zaostřovány v tenké oblasti gradientu el. napětí
Iontové složky Laemliho systému glycin Zvýšení mobility Gly iontů v pufru o vyšším pH Pohybují se před komplexy SDS-protein Snížení mobility proteinů v důsledku vstupu do koncentrovanějšího gelu Dělení proteinů na základě jejich velikosti (molekulární hmotnosti)
Nativní PAGE Blue Native (BN)-PAGE - využívá Coomassie blue → negativní náboj, nedenaturační Clear Native (CN)-PAGE - nedenaturační, dělení proteinů na základě náboje, velikosti a konformace → kombinace různých pufrů a gelů Spojení BN a SDS-PAGE - analýza komplexů Acidický Erytropoetin vystaven působení vyšší teploty → dimerizace
K vizualizaci proteinů dochází v roztoku Coomasie blue.
Barvení stříbrem 75 kDa 50 kDa 37 kDa 25 kDa 20 kDa 15 kDa 10 kDa Redukující PLB (5% merkaptoethanol), 3 µl vzorku s pufrem 1:1 15 % gel, 150V, 57 min, Marker – BioRad #161-0374, dual color, 1 µl,