Difuze Lékařská chemie a biochemie 2. ročník - zimní semestr Doc. Tomáš Navrátil, PhD. Difuze Lékařská chemie a biochemie 2. ročník - zimní semestr © Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, 2005 - 2020 1. LF UK a VFN v Praze Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky

Difuze limituje velikost buněk a jednobuněčných organismů je hlavním způsobem výměny látek v buňce a do značné míry i mezi buňkou a jejím okolím (O2) je dostatečně rychlá a efektivní na vzdálenost 15-25 m (např. od povrchu b.), to omezuje velikost metabolicky aktivních bb. na 30-50 m pro difuzi je limitujícím faktorem též plocha, na které probíhá (povrch b.) Poměr povrchu a objemu kulových bb v závislosti na jejich průměru PRŮMĚR (m) POVRCH (m2) OBJEM (m3) POMĚR povrch/objem 1 3,14 5,24 . 10-1 6,0 3 2,83 . 10 1,41 . 10 2,0 10 3,14 . 102 5,24 . 102 0,6 30 2,83 . 103 1,41 . 104 0,2 100 3,14 . 104 5,24 . 105 0,06 300 2,83 . 106 1,41 . 108 0,02 1000 3,14 . 106 5,24 . 108 0,006 Difuze 2019/2020

Živočišná buňka (schematicky) Difuze 2019/2020

STRUKTURA BUNĚČNÉHO JÁDRA jádro eukaryotních bb je obklopeno dvěma fosfolipidovými membránami vnitřní ohraničuje vlastní jádro vnější je spojená s rozsáhlým cytoplazmatickým membránovým systémem s navázanými ribozomy (nazývaný jako hrubé nedoplaz. retikulum) prostor mezi nimi je spojitý s lumen (vnitř. prostorem) nedoplaz. retikula v některých místech jsou obě spojeny a vytvářejí tak jaderné póry (ty pravděpodobně slouží k regulaci pohybu různých materiálů mezi jádrem a CP) chromozomy jsou v intervizi jen asi 25 nm tlusté a nejsou vidět ve světelném mikroskopu (jím vidíme v jádře jen jadérko obsahující oblast jednoho (či více) chromozomů, v anglosaské literatuře nazývanou nukleolární organizátor) tato oblast řídí syntézu ribozomální RNA v jadérku se k ribozomům připojují i některé rib. Proteiny částečně či úplně hotové rr se pak dostávají jadernými póry do CP přesná organizace a fungování buněk. jádra zatím nejsou známy v intervizi slouží jádro hl. k řízení syntézy RNA v proliferujících a diferencujících se bb je jádro vysoce metabolicky aktivní, v klidových („odpočívajících“) bb je inaktivní („spící“) a probíhá na něm jen nepatrná syntéza DNA a RNA děje probíhající v jádře a buňce při dělení b jsou probírány v histologii a biologii, jejich chem. aspekty viz. 2. pol.semestru Difuze 2019/2020

BUNĚČNÝ MEMBRÁNOVÝ SYSTÉM A ORGANELY dvouvrstva fosfolipidů obsahující proteiny, glykoprot. a glykolipidy v různém zastoupení může vytvářet řadu struktur s jedinečnou charakteristikou a funkcí eukaryotické bb na rozdíl od prokaryotních obsahují rozsáhlý a složitý systém vnitřních membrán, který není propojen s plazmatickou membr. tyto membrány uzavírají určité oblasti a oddělují je od zbytku CP – vytvářejí tak soubor různých podbuň. struktur, které nazýváme buněčné organely mezi ně počítáme mitochondrie, hrubé a hl. endoplazm. Retikulum, Golgiho aparát, lysosomy, peroxisomy a různé menší vehikuly u rostl. Bb jsou to navíc chloroplasty a vakuoly každá organela hraje jedinečnou roli při růstu a metabolismu b a obsahuje tomu odpovídající soubor specifických enzymů, katalyzujících zde probíhající chemické reakce Difuze 2019/2020

Endoplazmatické retikulum představuje vzájemně propojenou síť vnitřních membrán a je největší membránou eukaryotní b má v b řadu fcí – k nejdůležitějším patří syntéza mnoha membr. proteinů a lipidů podle toho, zda jsou na povrchu membrán navázány ribozomy rozeznáváme hrubé (s ribozomy) a hladké (bez nich) hladké ER je místem syntézy a metabolismu mastných k. a fosfolipidů, nejvíce je ho v jaterních bb obsahuje enzymy, které se účastní při modifikaci cizorodých látek (xenobiotik), mající usnadnit jejich vylučování z organismu (detoxikační fce); u experimentálních zvířat, kterým bylo podáváno větší množství cizorodých látek došlo ke zmnožení hl. ER v jater. Bb hrubé ER je místem syntézy řady membránových a organelových bílkovin a také místem, kde vnikají bílk.,které mají být secernovány mimo b; tyto proteiny se hromadí v lumen (vnitř. prostoru) hrubého ER největší množství se hr. ER je v bb specializovaných na sekreci proteinů – trávicí žlázy (pankreas) a bb produkující protilátky (ribozomy se vyskytují i volně v CP – slouží k tvorbě cytosolových proteinů – enzymů, receptorů a cytoskeletu) Difuze 2019/2020

STRUKTURNÍ HYPOTÉZA SYNTÉZY MEMBRÁNOVÝCH A SEKREČNÍCH PROTEINŮ NA ENDOPLAZMATICKÉM RETIKULU signální peptid se skládá z 15-30 převážně hydrofobních (nepolárních) aminokyselin u membránových proteinů se také odštěpuje, ale membr. protein zůstane zachycen v membráně svou hydrofobní oblastí u sekrečních dojde k úplnému průniku do lumen endoplazmatického retikula Difuze 2019/2020

STRUKTURNÍ HYPOTÉZA SYNTÉZY MEMBRÁNOVÝCH A SEKREČNÍCH PROTEINŮ NA ENDOPLAZMATICKÉM RETIKULU Difuze 2019/2020

Golgiho komplex představuje jakýsi „dopravní dispečink“ transportních systémů b, hraje klíčovou roli v třídění buněčných bílkovin a složek buněčných membrán a jejich odesílání na místo určení; k tomu je vybaven enzymy, které modifikují jednotlivé konstituanty procházející Golgiho komplexem na místo určení. může zde dojít k navázání „značky“ ve formě sacharidu či fosfátu, která pomůže při dalším transportu na místo určení- vstup se děje v cis oblasti, trans oblast je místem výstupu z Golgiho komplexu, v trans oblasti dochází k oddělování transportních vehikul (měchýřků), nazývaných také sekreční – tyto měchýřky v případě sekrece proteinů mimo b splývají s buněčnou membránou a tak dojde k exocytose – vylití obsahu sekrečních vesikul mimo b. Difuze 2019/2020

Malé vesikuly Lysosomy Peroxizomy mohou také „převážet“ složky membrán z jedné organely na druhou (i když zatím neznáme přesný mechanismus transportu). Lysosomy obsahují enzymy „kyselé hydrolázy“ pracující při pH okolo 5 a níže – tyto enzymy odbourávají biopolymery na jejich stavební složky (monomery) při neutrálním pH tyto enzymy nepracují, aktivují se snížením pH uvnitř lysosomu pomocí „protonové pumpy“ ( H+ dependentní ATP-ázy) Peroxizomy jsou malé, membránou ohraničené organely živočiš. Bb, podobají se lysosomům, ale mají jinou fci obsahují enzymy, které odbourávají mastné k. a AMK (tedy spíše „monomery“ než polymery) vedlejším produktem jejich činnosti je peroxid vodíku, který je pro b velmi nebezpečný; proto peroxizomy obsahují velké množství enzymu katalázy, která katalyzuje reakci 2 H2O2 (+kataláza) 2 H2O + O2 přesný význam peroxizomů v metabolismu b je ještě stále ve stádiu experimentálního zkoumání Difuze 2019/2020

ODDĚLOVÁNÍ BUNĚČNÝCH SOUČÁSTÍ Difuze 2019/2020

Separace hrubého endoplazmatického retikula, Golgiho aparátu a plasmatických membrán centrifugací na hustotním gradientu Čistota frakcí se ověřuje elektronovou mikroskopií čistota jednotlivých buněčných frakcí (organel) se zjišťuje pomocí elektronového mikroskopu (trvá déle) nebo pomocí enzymů, které jsou pro dané organely specifické stanovuje aktivita specifických enzymů a podle její výše se usuzuje na čistotu izolovaných buněčných organel Difuze 2019/2020

MECHANISMY ENZYMOVÉ KATALÝZY acidobazické - poskytnutí či přijetí protonu reaktantu, často se k tomu využívají ionizovatelné postr. řetězce AMK kovalentní - nukleofilní napadení substrátu katalyzátorem, přechodně vzniká kovalentní vazba, následovaná elektrofilní stabilizací vznikajícího negativního náboje na komplexu přechodového stavu reakce - jako kovalentní katalyzátory mohou sloužit postranní řetězce a koenzymy kovové ionty – katalyzují reakce tím, že stabilizují vznikající negativní náboje způsobem připomínajícím kyselou katalýzu mohou být pevně vázány (metaloenzymy) – nejčastěji Fe2+ i 3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co3+ (ale i řada dalších) nebo mohou být volně vázány z roztoku (Na+, K+, Mg2+, Ca2+) a svou přítomností enzym aktivovat (bez nich je nefunkční) vazbou na substrát, aby byl vhodně orientován pro reakci zprostředkování redox reakce reverzibilními změnami kovového iontu v oxidovaném stavu elektrostatickou stabilizací nebo odstíněním negativních nábojů působí podobně jako proton (Lewisova kyselina), jsou však mnohem účinnější, protože mohou být přítomny ve vysoké koncentraci i při neutrálním pH a mohou mít náboj větší než 1+ („super kyseliny“); jejich přítomnost způsobuje, že na ně vázané molekuly H2O jsou kyselejší než volná H2O a jsou zdrojem –OH iontů – vzniklá hydroxylová skupina vázaná kovovým iontem je silným nukleofilem (blíže viz Voet-Voetová biochemie) Kovové ionty se účastní katalýzy třemi způsoby: Difuze 2019/2020