Enzymová kinetika

Proč studovat enzymovou kinetiku? Enzymová kinetika studuje časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných enzymy Rychlost enzymové reakce závisí na: koncentrace substrátů koncentraci enzymu Fysikálně chemické vlastnosti prostředí (iontová síla, pH, teplota...) Přítomnost aktivátorů a inhibitorů Proč studovat enzymovou kinetiku? Charakterizace substrátové preference enzymů Identifikace a studium inhibitorů

Typy enzymových reakcí Jednosubstrátové reakce Jeden substrát jeden produkt (isomerasy) Jeden substrát dva produkty (lyasy) Jeden substrát a voda dva produkty (hydrolasy) Dvousubstrátové reakce Dva substráty dva produkty (oxidoreduktasy, transferasy) Dva substráty jeden produkt (lyasy) Třísubstrátové reakce Dva substráty a ATP  jeden hlavní produkt a dva produkty z ATP (ligasy)

Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu V roce 1902 Brown studoval rychlost hydrolytického štěpení sacharosy na glukosu a fruktosu enzymem b-fruktofuranosidasou: sacharosa + H2O glukosa + fruktosa Při konstantní koncentraci sacharosy (a různé koncentraci enzymu) byla závislost počáteční rychlosti reakce na koncentraci enzymu lineární

Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu Pokud je koncentrace enzymu konstatní, a mění se koncentrace substrátu, je závislost počáteční rychlosti na koncentraci substrátu hyperbolická

Enzymová kinetika Leonor Michaelis Maud Menten

Enzymová kinetika – matematické odvození Cíl: vypracování rovnice vyjadřující rychlost katalyzované reakce Jako příklad uvažujme jednoduchou nekatalyzovanou reakci: S ===> P Rychlost reakce je charakterizována rychlostí přírůstku produktu P Reakční rychlost je přímo úměrná koncentraci substrátu [S]

Rovnice Michaelise a Mentenové k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 Základním předpokladem je existence komplexu enzym-substrát (ES) k1 je rychlostní konstanta pro tvorbu ES (rychlost = k1 [E][S]) k-1 je rychlostní konstanta pro disociaci ES (rychlost = k-1 [ES]) Celková rychlost reakce je:

Rovnice Michaelise a Mentenové Nemůžeme ale snadno měřit [ES]. Cílem je stanovit [ES] jako funkci parameterů které můžeme měřit. Michaelis a Mentenová použili dva základní předpoklady: 1. Předpokládáme, že k1 a k-1 jsou podstatně větší než kcat, takže enzym a substrát jsou v rovnováze. V rovnováze je rychlost tvorby komplexu [ES] stejná jako rychlost jeho disociace, takže: k1[E][S] = k-1[ES] Po úpravě: kde KS je definována jako rovnovážná disociační konstanta.

Rovnice Michaelise a Mentenové 2. Předpokládáme že počáteční koncentrace substrátu [S]o, je mnohem větší než celková koncentrace enzymu [E]tot, takže během prvé periody enzymové reakce (než je spotřebována podstatná část substrátu), je koncentrace volného substrátu stejná jako původní celková koncentrace substrátu (která je při expertimentu známa): tj.. [S]o >> [E]tot takže [S] ≈ [S]o Omezíme pozorování a výpočty pouze na počáteční rychlost reakce.

Rovnice Michaelise a Mentenové E + S <===> ES ===> P + E Enzym není v průběhu reakce spotřebováván, takže: [E]tot = [E] + [ES] Náhrada za [E] (zavedení KS): Přeskupení: Tedy:

Rovnice Michaelise a Mentenové Toto je rovnice hyperboly. Pro [S] v  kcat[E]tot kterou definujeme jako vmax. Máme tedy: kde vmax = kcat[E]tot (Připomenutí: [S] ≈ [S]o a v je počáteční rychlost reakce.) zero order 1st order [S] = Low → High

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Nemůžeme předpokládat, že k1 a k -1 jsou vždy větší než kcat Místo předpokladu rovnováhy mezi E, S a ES, uvažujeme tvorbu ustáleného stavu. Předpokládáme, že (pro [S]o >> [E]tot) reakce rychle dosáhne stav během kterého je koncentrace [ES] konstantní. Předpokládáme tedy: Reakční schéma je: k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 reakční rychlost v = kcat[ES] Steady state Time v or [ES]

Konstantní koncentrace ES v ustáleném stavu Concentration P 後來 的研究發現，確實有酵素與基質的結合體存在，此一結合體 ES 的濃度在整個反應過程中，呈現一平衡狀態。在酵素與基質剛混合後，尚未達到 ES 的平衡狀態時，特稱之為 pre-steady state。 ES E Reaction Time

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 Steady state Time v or [ES] k1 [E][S] = k-1[ES] + kcat [ES] Úprava: Tedy: kde KM je známa (nepřesně!!) jako Michaelisova konstanta. Pokud k-1 >> kcat, KM  KS (= k-1/k1).

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Pro výpočet reakční rychlosti použijeme stejný postup: Enzym není spotřebován: [E]tot = [E] + [ES] Náhrada za [E] (z výrazu pro KM): Úprava: Tedy: kde vmax = kcat[E]tot.

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Tyto dva postupy vedou k podobným rovnicím: Michaelis-Menten Briggs-Haldane vo = Vmax [S] Km + [S]

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea B-H poskytuje obecnější rovnici pro rychlost enzymových reakcí. Pro usnadnění výpočtů je často používána v reciproké formě. Převrácením obou stran rovnice dostaneme: Graf 1/v proti 1/[S] poskytuje přímku se směrnicí KM/vmax a úsekem na ose y o hodnotě 1/vmax 1/v 1/[S] KM/vmax 1/vmax Double-reciprocal Lineweaver-Burke Plot -1/KM

Km: Afinita vůči substrátu vo = Vmax [S] Km + [S] If vo = Vmax 2 Vmax 2 = Vmax [S] Km + [S] When using different substrate Vmax S2 S1 S3 1/2 Km + [S] = 2 [S] 由 上面公式推導，可知我們所設定出來的 Km 常數，居然正是要達到一半最高速率 Vmax 時的基質濃度。因此 Km 越高，若要達到最高速率時，所添加基質的濃度也要越高，表示該基質與酵素的親和力並不是很好 (上面左下圖)。 一般酵素不可能在細胞內以最高速率進行催化反應，若以二分之一的最高速率進行，則此基質濃度剛好是 Km，因此推測細胞內酵素的基質濃度可能是其 Km。 S1 S2 S3 Km = [S] Km Affinity changes

Důležitost KM Nezávisí na koncentraci enzymu Závisí na reakčních podmínkách Hlavní substrát má nejnižší KM Koncentrace substrátu pro dosažení limitní rychlosti je cca 100 KM

KM

Km = 8 8,000 5 mM Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP Km: příklad hexokinasy Glukosa Allosa Manosa Substrát číslo CHO H-C-OH HO-C-H H2-C-OH CHO H-C-OH H2-C-OH CHO HO-C-H H-C-OH H2-C-OH 1 2 3 4 5 6 Hexokinase 可以催化數種六碳糖 (如 glucose, allose, mannose 等)，但三者的 Km 相差甚大。 Hexokinase 對 glucose 及 mannose 有較大的親和力 (因 Km 低)，而對 allose 親和力很差 (Km 為 8,000 mM)。 檢查比對這三種單糖的分子構造，發現三號碳上面 -OH 基的立體構形有很大的影響；hexokinase 偏好類似 glucose 的構形。 由此結果反推回去想像 hexokinase 的構造，可以推測 hexokinase 與基質結合的活性區，一定有相當專一的空間排列，其空間排列形狀可以與葡萄糖的形狀互補；而且對葡萄糖分子上的三號碳特別挑剔，但對二號碳則較為寬容。 Km = 8 8,000 5 mM

Číslo přeměny, molární aktivita enzymu, kcat (vo) E + S ES E + P k2 k1 kcat kcat, číslo přeměny (turn over number, t.o.n) Počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu za jednu sekundu 回來 看 M-M 公式，當基質量 [S] 極大時，Km 可以忽略，則 vo = Vmax；代入四條基本觀察中的 (III) vo = k3 [ES] 以及 (IV) Vmax = k3 [Et]，可推得 [ES] = [Et]。表示當基質很大時，所有的酵素全部轉成 [ES]，在此種狀況下，酵素的反應事實上只要看後半段，即 ES → E + P，而此段反應是受到 k3 的控制；此時可以表現出一個酵素的最大催化能力，就特別把 k3 稱為 kcat，即為 turn over number (t.o.n.) 或稱為 molecular activity，是表示一個酵素活性速率的絕對指標。 若基質量遠小於 Km 時，則可如上圖推演，得到 vo = (k3/Km) [E][S]；此時的反應速率受到 [E] 及 [S] 兩者的控制，是一種二級反應；而其常數 k3/Km (kcat/Km) 是酵素對某基質催化能力的指標 (k3 以及代表親和力的 Km)。 以上兩種表示法，我們各舉了數種例子。

Číslo přeměny vybraných enzymů Enzymy Substrát kcat (s-1) Katalasa H2O2 40,000,000 Karbonát-hydrolyasa HCO3- 400,000 Acetylcholinesterasa Acetylcholin 140,000 b-Laktamasa Benzylpenicilin 2,000 Fumarasa Fumarát 800 常數 k3 控制的是生成物的產生速率，因此也可看作一個酵素最後轉換出生成物的速率，特稱之為 turn over number (t.o.n)，也是一個重要指標。 注意其單位為 s-1，亦即每秒鐘能夠轉換得到生成物的分子數目；例如上面 RecA 的 t.o.n. 為 0.4，表示此酵素要 2.5 秒才能使用一分子 ATP 生成 ADP (DNA 重組時需要此酵素)。 Počet molekul produktu získaného ze substrátu jednou molekulou enzymu za sekundu Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

Jak stanovit KM a V 1) použij známé množství enzymu → E 2) přidej substrát v různých koncentracích → S (osa x) 3) změř produkt v určeném čase (P/t) → vo (osa y) 4) (x, y) graf, hyperbolická křivka, limita → Vmax 5) pokud y = 1/2 Vmax spočti x ([S]) → Km Vmax S vo 1/S 1 vo 1/2 上圖 是進行酵素動力學的實際操作過程，所需要的設備通常相當簡單，操作方法一般也並不很困難，要看該酵素活性分析方法之難易而定。但由動力學實驗所得的資料很重要，可以得知一個酵素與其基質之間的關係，以及該酵素的最大活性，甚至可能推得酵素的作用機制。 通常大學部所開的生化實驗中，都是以 invertase 作為實驗範例，進行當時 Michaelis 與 Menten 的動力學觀察。 - 1 Km 1 Vmax Km Double reciprocal Direct plot

Jednotky enzymové aktivity S → P mmol t Produkt [P] vo = [P] / min směrnice tan Unit = mmol /min 0 10 20 30 40 一般 測定酵素活性時，是在單位時間內測定所得到生成物的量，如上圖所示。若生成物以 mmole 表示，則酵素每分鐘催化產生得到 1 mmole，稱為一個活性單位。若活性單位再除以蛋白質的 mg 數目，即得比活性。 在一定時間內測量生成物時，要注意生成物的生成量與反應時間要成正比；要取用如上面右圖所示的直線關係部份，反應時間在 30 min 之內都可以，但反應在 40 min 以後，生成物已不成線性關係，測出來的活性不準確 (會低估或高估？)。 Reakční doba (min) Specifická aktivita = Jednotky aktivity y x = tan y Protein (mg) x

kcat / Km (katalytická účinnost) chymotrypsinu O R O H3C–C–N–C–C–O–CH3 H H = – kcat / Km R = Glycin –H 1.3 ╳ 10-1 –CH2–CH2–CH3 Norvalin 3.6 ╳ 102 –CH2–CH2–CH2–CH3 Norleucin 3.0 ╳ 103 用 kcat/Km 可以同時兼顧前半與後半反應，也就是說同時監視酵素對基質的親和力，以及該酵素的 Vmax (kcat)，是一個比較理想的酵素行為指標； 此一比值越大者，有越好的催化力。由上例可以看出，酵素對不同基質會有不同的表現，chymotrypsin 顯然偏好較大的胺基酸基團，且最好有芳香基團。 酵素的成功催化首先需與基質碰撞，而兩者的碰撞率決定在細胞內的擴散率，但是細胞內的擴散率有其極限；有人由此算出若在最高的擴散速率下，且每次碰撞都完成催化，則一個酵素最高的催化極限，其 kcat/Km 將在 10 8~10 9 (M-1s-1) 之間；的確最有效的酵素催化也都趨近此一範圍，目前最高的記錄是 triose phosphate isomerase 的 2.4×10 8。 –CH2– Phenylalanin 1.0 ╳ 105 (M-1 s-1) Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

Porovnání vybraných parametrů KM  čím nižší hodnota, tím je přeměňovaná látka vhodnějším substrátem kcat  čím vyšší hodnota, tím více molekul substrátu je přeměňováno za jednotku času kcat / KM  čím vyšší hodnota, tím je enzym účinnější

Jak zvýšit rychlost reakce přídavek enzymu (zvýšení [E]tot) přídavek substrátu (zvýšení [S]) modifikace enzymu (optimalizace kcat nebo KS ) vo = Vmax [S] Km + [S]

Kinetika vícesubstrátových reakcí Nejčastěji přeměna dvou substrátů na dva produkty Reakce může probíhat různými mechanismy

Mechanismus následný (postupný, sekvenční) uspořádaný Vazba prvého substrátu A změna konformace komplexu (indukované přizpůsobení) vazba druhého susbtrátu B (volný enzym má pro něj malou afinitu) vznik komplexu EAB Přeměna komplexu EAB na EPQ (enzym s reakčními produkty) Postupné oddělení jednoho a poté druhého produktu Využíván např. u oxidoreduktas (substrát A je NAD+)

Mechanismus následný (postupný, sekvenční) náhodný Pokud nezáleží na sledu vazby substrátů na enzym a na pořadí uvolňování produktů Enzym má zhruba stejnou afinitu k oběma substrátům

Mechanismus ping-pongový Na enzym se naváže prvý substrát, dojde k reakci, oddělí se prvý produkt Substrát předá nějakou skupinu  enzym se uvolní v pozměněné formě Poté připojení druhého substrátu, který převezme od enzymu skupinu z prového substrátu Poté uvolnění produktu a obnova enzymu Transferasy