Laboratórna diagnostika očkovaním preventabilných ochorení Nováková, E.: NRC HI, RÚVZ v Žiline Ústav mikrobiológie a imunológie JLF UK v Martine Laboratórna diagnostika očkovaním preventabilných ochorení Vakcinačný deň SR Žilina 27.9.2008

Priamy dôkaz vyvolávateľa - baktérie v odobratej vzorke z miesta momentálneho výskytu - mikroskopicky (tetanus) - kultivačne (diftéria, pertussis) - dôkaz antigénu (v CSM ) - dôkaz NK (PCR – M. tbc,)

Priamy dôkaz vyvolávateľa - 2 vírusy zo vzorky odobratej z miesta výskytu elektronová mikroskopia imunofluorescenčná mikroskopia dôkaz antigénu (rotavírus), HIT VNT dôkaz NK (HPV zo steru krčka maternice) - Izolácia vírusu - pomnoženie (tkanivové kultúry, kuracie embryo, bunkové kultúry) - identifikácia (CPE, mikroskopia, IFA, dôkaz antigénu HIT, VNT)

Nepriamy dôkaz vyvolávateľa Dôkaz protilátok v sére pacienta sérologickými reakciami: Antigén + protilátka celkové protilátky – 2 vzorky s intervalom 14 dní s dôkazom signifikantného vzostupu geometrického titra protilátok protilátky typu IgM, IgG, IgA a ich dynamiky

BCG – Mycobacterium tbc BCG - Bacillus Calmette Guérin - očkovanie kmeňom Mycobacterium bovis - skrížená imunita s Mycobacterium tbc. priama diagnostika ochorenia (v centrách -- mikroskopicky (predbežná) -- kultivačne 6-9 tyždňov -- PCR skrátenie diagnostiky

BCG – Mycobacterium tbc Stanovenie špecifickej imunity určenie úrovne individuálnej imunity (po očkovaní) odhalenie latentnej infekcie (pred imunosupresívnou terapiou) in vivo Mantoux in vitro IGRA (Quantiferon)

IGRA – interferon gama release assay Quantiferon TB– in vitro test na stanovenie špecifickej bunkami sprostredkovanej imunity metóda určená na detekciu ochorenia a monitorovanie in vitro stanovenie aktivity CMI v plnej krvi

Bežný postup pri vyhľadávaní latentnej tbc infekcie Mantoux – in vivo test na stanovenie bunkovej špecifickej odpovede po expozícii antigénu PPD (spoločný pre M.tbc aj BCG) - záťaž antigénom v teréne imunodeficitných pacientov - možná anergia - pamäťové bunky po BCG vakcinácii, - nízka špecificita, nízka senzitivita, - boostrovanie PPD antigénom

Iná možnosť – dôkaz bunkovej imunity in vitro Quantiferon / IGRA in vitro testovanie špecifickej imunity po expozícii plnej krvi pacienta antigénom špecifickým pre M. tbc budú stimulovať len špecifické pamäťové bunky po kontakte s M.tbc antigénmi bez skríženej reakcie s antigénmi BCG vakcíny antigén nie je podaný pacientom – vylúčenie rizika expozície u imunosuprimovaných antigén neboostruje pamäťové bunky pacienta

Interpretácia: latentna nešpecif Skúmavka s krvou pacienta a M.tbc antigénom Negat kontrolka – vylúči nešpecifickú sekréciu (napr. po liečbe) Pozit.kontrolka – ukáže schopnosť reagovať (negat. u imunokompromitovaných alebo po terapii) pozit pozit negat negat negat pozit negat negat pozit pozit pozit negat negat negat . falošne

Porovnanie Mantoux: in vivo reagujú pamäťové bb po BCG aj po M.tbc. stimulácii aplikácia PPD i.d. zápal s induráciou v mieste vpichu Quantiferon: in vitro pamäťové bb po M.tbc infekcii stimulované in vitro sekrécia cytokínov dôkaz: ELISA

Corynebacterium diphtheriae záškrt – diftéria NRC – ÚVZ Košice Corynebacterium diphteriae - gram pozitívna palička. Kultivačné vyšetrenie – je dobré upozorniť laboratórium Toxigénny kmeň - toxigenicitu kmeň získa prostredníctvom bakteriofága, nie všetky kmene sú toxigénne Testovanie toxigenity kmeňa - Elekov test imunodifúzie in vitro

Diftéria - imunita protektívna antitoxická imunita – stanovenie hladiny antitoxických protilátok IgG (metóda ELISA) – je dôležité udržovať antitoxickú imunitu na dostatočnej úrovni -- Schickov kožný test - dôkaz neutralizujúcich protilátok - i.d. podaním difterického toxínu

Tetanus G + sporulujúca anaeróbna palička Mimo tela prežíva roky ako odolná spóra V tele za anaeróbnych podmienok germinuje na vitálnu baktériu produkujúcu toxín diagnostika – obvykle stačí klinická mikrobiologicky – typický obraz v mikroskopickom preparáte po germinácii spóry kultivačne – anaeróbna kultivácia – klinicky bezvýznamná dôkaz toxínu – laboratórne na laboratórnych myšiach alebo imunoanalýzou (klinicky bezvýznamná)

Antitoxická imunita – dôkazom antitoxických protilátok Dôležité je udržiavať dostatočnú hladinu antitoxickej imunity Po prežitom ochorení neexistuje špecifická imunita – nie je dostatočný antigénny stimul - preočkovať

Pertussis - čierny kašeľ Bordetella pertussis - gram negatívna palička Diagnostika – priama – zriedkavo požadovaná - veľmi náročná (odber, diagnostické pôdy, dlhodobá kultivácia) -- nepriama – aglutinačné protilátky z 2 odberov z odstupom 14 dní alebo --špecifické IgG, IgM , IgA

Čierny kašeľ stanovenie imunity ELISA IgG NRC ÚVZ Banská Bystrica Konfirmačné vyšetrenie PCR B

Hemofilové invázne ochorenia Haemophilus influenzae typ b – Očkovanie nezabráni -- infekciám horných dýchacích ciest, -- prítomnosti H.influenzae na sliznici -- ochoreniam opúzdranými kmeňmi typu a, c, d, f Diagnostika – priama – kultivačne z HK (invázne ochorenia) a CSM, punktát tkaniva -- mikroskopicky z CSM, -- dôkaz antigénu z !!!nikdy neodoberať vzorku pri epiglotitíde!!!

NRC RÚVZ Žilina Dôkaz protilátok nemá diagnostický význam stanovenie antiinfekčnej imunity – dôkaz špecifických protilátok metódou ELISA

Pneumokokové invázne ochorenia Priama diagnostika – kultivačne krv na hemokultiváciu, CSM, aspirát z pľúc Streptococcus pneumoniae Dôkaz existencie púzdra – podľa rastových charakteristík, Burriho metóda negatívneho farbenia Určenie sérotypu – polysacharidové púzdro (96 typov) – nepriama aglutinácia špecifickými sérami – dostupná – klinicky nevýznamná (epidemiologicky významná)

Dôkaz protilátok proti Str.pneumoniae Stanovenie špecifických protilátok – (proti 23 antigénom) – ELISA – postvakcinačné, postinfekčné protilátky postvakcinačné – typovo špecifické chránia predovšetkým pred inváznymi ochoreniami (meningitída, pneumónia) Str.pneumoniae daného sérotypu významný je vplyv kolektívnej imunity na zníženie používania antibiotík

MMR – osýpky, mumps, ružienka diagnostika v minulosti klinická laboratórna -- sérologický dôkaz IgM protilátok – – virologická diagnostika vírusu Interpretácia výsledkov – špecificita použitých testov, -- nešpecifická stimulácia protilátky produkujúcich buniek (u tehotných a v priebehu iných infekcií -- laboratórny výsledok je pomocným U očkovaných a pri kolektívnej imunite je významný klinický obraz a epidemiologická anamnéza

NRC ÚVZ Bratislava

Skríning intrauterinnej infekcie vírusom rubeolly teratogénny účinok vírusu pri primoinfekcii tehotnej - Greggov sy vyšetrenie IgM protilátok - pozitivita = akútne ochorenie = včasné Ab po očkovaní možnosť nešpecifickej polyklonálnej aktivácie a pozitivity testu u tehotných prítomnosť protektívnych IgG v populácii po očkovaní

Poliomyelitída NRC ÚVZ Bratislava Klinická diagnostika + konfirmácia izoláciou vírusu Diagnostika – priama zo stolice (nie výter) – -- nepriama – dôkaz postvakcinačných alebo postinfekčných protilátok (KFT, VN T)

Hepatitída A – stanovenie protilátok anti HAV total (IgM+IgG) -- anti HAV IgM IgM = akútné ochorenie alebo po 1. dávke OL

Hepatitída B – antiHBs – po očkovaní aj po ochorení -- po ochorení aj anti HBc total -- ochorenie HBsAg, HBcIgM, HBeAg – aktívna infekcia

Ďalšie typy očkovania Kliešťová encefalitída – diagnostika nepriama ELISA IgM -- IgG – prekonané ochorenie alebo po očkovaní Rotavírusová enteritída -- diagnostika ochorenia priama Latex aglutinácia zo stolice -- antiinfekčná a postvakcinačná sa nestanovuje

Očkovanie proti chrípke NRC ÚVZ Bratislav V. chrípky - typ A alebo B v období epidémie je diagnstika klinická dôkaz priamy pre epidemiologické účely a identifikáciu vírusu – virologická diagnostika – odber – výplach z nazofaryngu do transportného média dôkaz nepriamy – IgG, IgM a IgA protilátky – špecifické pre daný typ chríkového vírusu

HPV infekcia krčku maternice HPV – prekanceróza -- diagnostika priama -- ster z krčka maternice -- histologické vyšetrenie PAP smear dôkaz prítomnosti LR alebo HR HPV – genetickou sondou (alebo PCR) Existencia viacerých typov – najviac 16 a 18 (podľa zahraničných štúdií) Význam vyšetrenia – identifikácia infekcie bez klinických prejavov = dôležitosť preventívnych vyšetrení

Stanovenie individuálnej imunity Prítomnosť špecifických protilátok po vymiznutí – existencia pamäťových buniek stačí booster dávka stanovenie existencie anamnestickej odpovede – ELISPOT pri antitoxickej imunite (dostatočná hladina)

ELISPOT metóda používaná na detekciu sekrécie cytokínov (napr. pri vývoji vakcín) stanovuje aktivitu špecifických buniek po expozícii antigénu in vitro

+ špecifický antigén = = produkcia cytokínov ich stanovenie

Ďakujem za pozornosť