Ostatní metody získávání molekulárních dat Pokud bychom měli k dispozici kompletní genomové sekvence organismů, které chceme studovat, žádné takové metody bychom nepotřebovali. Jenže je nemáme a jejich sekvenování je stále pro větší množství vzorků neprakticky drahé. Následující metody umožňují rychle a často levně získat dostatečné množství dat pro otázky, které v molekulární taxonomii řešíme.

DNA-DNA hybridizace Stanovit střední teplotu tání homoduplexů Tm= (TmA + TmB)/2 Stanovit teplotu tání heteroduplexu -Tms Vypočítat pokles ΔTm ∆Tm=Tm - Tms Vypočítat p (podíl rozdílných nukleotidů) p = ΔTm . 0,01 (0,015) Používá se snad jen v bakterální systematice, za hranici druhu je považován pokles Tm o 30% (~ 5% rozdílu nukleotidů)

DNA-DNA hybridizace Výhody Multilokusová (totilokusová) metoda Nevýhody Distanční metoda Experimentálně dosti náročná Vyžaduje větší množství DNA Náchylná k artefaktům (repetitivní DNA) Experimentální náročnost N x N

ORGI (overall genome relatedness indices) Snaha najít jednoduchou míru podobnosti porovnáním celých genomů (v budoucnu nahradí DNA hybridizaci) V současnosti osekvenováno více než 30 000 bakteriálních genomů ANI (average nucleotide identity) – průměrná identita všech homologních úseků rozpoznaných pomocí BLASTN (Goris a kol. 2007) – hranice bakteriálního druhu 95-96%. Frekvence 4 nukleotidových „slov“ (Richter a Rosseló-Móra 2009) GBDP – průměrná genetická vzdálenost vypočtená z celkového alignmentu dvou genomů (Meier-Kolthoff a kol. 2013) – hranice bakteriálního druhu 0,258. MUMi – podíl oblastí s dokonalou shodou na celkové délce porovnávaných genomů (Deloger a kol. 2009).

ORGI (overall genome relatedness indices)

IZOENZYMOVÁ ANALÝZA Isozymy – enzymy vykazující stejnou nebo podobnou aktivitu. Alozymy – podmnožina isozymů, alelické formy téhož enzymu (v jednom lokusu) Zymodem -taxonomická jednotka vymezená na podkladě isozymového vzoru

IZOENZYMOVÁ ANALÝZA

IZOENZYMOVÁ ANALÝZA Princip Detekce elektroforetickou mobilitou se lišících forem enzymů kódovaných různými alelami určitého genu. Jednotlivé enzymy se detekují prostřednictvím jejich specifické aktivity, většinou pomocí spřažené enzymatické reakce s barevným produktem.

RESTRIKČNÍ ANALÝZY Izolace DNA Nastříhání DNA pomocí restrikčních endonukleáz Velké množství endonukleáz, možno použít i jejich kombinace Problémy s přílišnou komplexitou vzorů Snížení komplexity výchozí DNA Kvalita separace fragmentů Detekce jen určitých zón EcoRI

RESTRIKČNÍ ANALÝZY RFLP bakteriální DNA Komplexita bakteriálního genomu je nízká, a proto vzniká i méně komplexní vzor, ze kterého je možno odečíst jednotlivé pruhy Celková DNA po naštěpení rozdělena na PAGE a obarvena EtBr

RESTRIKČNÍ ANALÝZY RFLP organelové DNA Izolovaná cpDNA naštěpena enzymy, rozdělena na agarose a obarvena EtBr.

RESTRIKČNÍ ANALÝZY mtRFLP – krok 1 Celková DNA rozštěpena, rozdělena na agarose, obarvena EtBr

RESTRIKČNÍ ANALÝZY mtRFLP – krok 2 – Southern blot

RESTRIKČNÍ ANALÝZY mtRFLP – krok 2 DNA z agarosy přeblotována na nylon, hybridizována s mtDNA sondou a detekována autoradiograficky.

RESTRIKČNÍ ANALÝZY VNTR – Variable Number of Tantem Repeats Využívá polymorfismus v počtu kopií tandemových repetic – minisatelitů (10-60 nt). Tento polymorfismus je velmi variabilní i mezi jedinci téhož druhu. Celkovou DNA naštípeme restrikční endonukleázou, která neštěpí uvnitř minisatelitu. Naštípanou DNA přeblotujeme na membránu a hybridizujeme se značenou próbou proti minisatelitu, pokud chceme zviditelnit všechny lokusy (obrázek vpravo), nebo proti minisatelitu a unikátní sekvenci v sousedství, pokud chceme zviditelnit jen jeden lokus (obrázek dole).

RESTRIKČNÍ ANALÝZY Výhody Relativní jednoduchost a láce Velké množství dat Slušná reprodukovatelnost Multilokusový charakter Selekční neutralita znaků U některých variant kodominance znaků

RESTRIKČNÍ ANALÝZY Nevýhody Potřeba většího množství DNA Potřeba kvalitnější a čistší DNA Spíše pro příbuzné druhy Někdy špatně čitelné elektroforetogramy – nutnost snižovat komplexitu DNA Znaky nemusí být nezávislé Spíše distanční metoda

Mikrosatelity Mikrosatelity - (nazývané i STR - Short Tandem Repeat) jsou krátké sekvenční motivy (dinukleotidy až hexanukleotidy) vyskytující se na některých místech genomu v mnoha tandemově uspořádaných kopiích o celkové délce až 150 jednotek repetice. Průměrně 1x za 1000 generací dochází k mutacím, při kterých se mikrosatelit prodlouží nebo zkrátí obvykle o jednu jednotku repetice. Proto existuje velmi značný vnitropopulační polymorfismus v délce alel a tento polymorfismus můžeme snadno studovat PCR amplifikací daného lokusu.

Mikrosatelity

Mikrosatelity Postup při analýze najít vhodný lokus (genomová knihovna a hybridizace nebo vyhledávání v genomových datech) připravit PCR primery ohraničující daný lokus amplifikovat lokus elekroforéza amplifikovaných fragmentů

Mikrosatelity

Mikrosatelity

Mikrosatelity Využití metody vnitrodruhové studie či příbuzné druhy kodominance znaků – populační genetika modernější a přesnější varianta alozymové analýzy možno analyzovat velké množství vzorků nákladné pouze zavedení metody pro nové organismy

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Amplifikace pomocí „náhodných“ primerů Různé metody zvyšování počtu znaků Kombinace primerů, restrikce enzymy, semiselektivní primery (transposomy)

RAPD Výhody Cena Rychlost Univerzálnost Malé množství materiálu Nižší požadavky na kvalitu DNA Obrovské (libovolné) množství dat

RAPD Nevýhody Neprodukuje věrohodné znaky (mnoho falešných homologií), při analýze je třeba převést na genetické vzdálenosti Použitelné jen u relativně příbuzných druhů Chybí kodominance Interference znaků Vliv kontaminující DNA Nízká reprodukovatelnost PCR

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

AFLP kapilárová elektroforéza standard molekulární váhy amplifikované fragmenty

AFLP Výhody Vysoká reprodukovatelnost výsledků Velké množství znaků Kodominance znaků? Minimum falešných homologií Lze použít znakově orientované metody Nevýhody Nákladnost kitů i přístrojového vybavení Složitost metody Spíše pro příbuzné druhy

PŘESTÁVKA

Protein mass fingerprint Sauer a Kliem 2010, Nature reviews microbiology Nomura 2015, BBA

Protein mass fingerprint

DNA/RNA mass fingerprint Sauer a Kliem 2010

VYUžití repetitivní DNA Repetitivní DNA se vyskytuje na mnoha pozicích v genomu. Poloha těchto DNA elementů se liší i mezi jedinci téhož druhu.

VYUžití repetitivní DNA Varianty RAPD používající jeden nebo oba primery nasedající na konzervativní LTR repetici na koncích LTR retrotranspozonů a polymerace směřuje směrem ven z retrotranspozónu. Zvyšuje se tak reproducibilita metody. IRAP – jeden primer nasedající na LTR REMAP – druhý primer nasedá na mikrosatelity R-RAP – druhý primer je náhodný jako u RAPD

SINE Short INterspersed repetitive Elements Retroposony derivované z tRNA, případně 7 SL RNA (Alu). Velikost: 70-500 PB. Vytvářejí značnou část eukaryotického genomu, často až 104 kopií na genom. Výhodou pro molekulární fylogenetiku je skutečnost, že existuje jen malá pravděpodobnost, že by se u dvou nepříbuzných organismů vložily do stejného místa a je téměř vyloučeno, že by se bezestopy z daného místa vystřihly.

ZNAKY a jejich formy x1, y1, z1 = plesiomofie x2 = synapomorfie (homologie) pro BCD y2 = autapomorfie pro B z2 = homoplázie (konvergence) pro ED

SINE Postup Najít nový SINE element: vyhledávání v genomových datech, náhodné sekvenování genomu, skríning genomové knihovny sondou proti SINE. Vytipovat SINE lokusy které jsou polymorfní u studovaného taxonu. PCR amplifikace vybraného lokusu. Ověření přítomnosti nebo absence SINE sekvenací nebo hybridizací se sondami

SINE PCR produkty EtBr Hybridizace se SINE probou Hybridizace s okolní unikátní sekvencí

SINE Nikaido a kol. 1999

SINE Chen a kol. 2011

SINE Nesouhlas přítomnosti SINE s fylogenezí druhů může poukazovat na „incomplete lineage sorting“ – mezi dvěma blízkými speciačními událostmi nedošlo k vytřídění polymorfismu v populaci. Abdel-Halim Salem a kol. 2003 PNAS

SINE Výhody a nevýhody použitelná pro vyšší taxony (maximálně však 75-100 milionů let málo znaků – není možno počítat délku větví unikátní události - synapomorfie, a proto lze data velmi snadno interpretovat Umožňuje polarizovat fylogenezi – víme, že původní stav je nepřítomnost SINE

Single Nucleotide Polymorphism SNPs Single Nucleotide Polymorphism Polymorfimus DNA, kdy se jedinci nebo druhy liší v jedné nukleotidové záměně AAGCCTA AAGCTTA V tomto případě mluvíme o alelách C a T. Téměž všechny SNPy mají jen 2 alely. Genom dvou lidí se liší zhruba v 3 mil. bazí (ne všechno jsou SNP).

SNPs

SNPs

SNPs genotypizace Hybridizační metody Hybridizační metody Enzymatické metody Metody založené na fyzikálních vlastnostech DNA Hybridizační metody Molecular beacon

SNPs – hybridizační metody 906 600 lidských SNPs

SNPs – enzymatické metody Primer extension – např. Infinium (Illumina) https://emea.illumina.com/science/technology/beadarray-technology/infinium-assay.html?langsel=/cz/

SNP – OSTATNÍ METODY Single-Strand Conformation Polymorphism PCR denaturace renaturace vertikální elektroforéza + + + _ _ _ vizualizace

Srovnání metod Metoda DNA hybri dizace Mass fingerptinting Mikro satelity RFLF (VNTR) SINE RAPD AFLP SNP Počet lokusů Všechny Mnoho Jeden Jeden / mnoho Repliko vatelnost Různá Vysoká vysoká Povaha znaků Distance Kodominantní Kodomi nantní Kodomi nantní Vzácná událost Domi nantní Kodominantní? Kodo minantní Rozlišení Střední vysoké Vysoké Nízké Jedno duchost provedení Těžké duché - Doba trvání Krátká Dlouhá