C7900 Lehká biotechnologie 06 – Terapeutika a farmaceuticky významné látky Petr Zbořil

Osnova prezentace Produkce antibiotik. Penicilin, etapy vývoje produkčních podmínek. Biosyntetické dráhy, ovlivnění produkce. Polosyntetické peniciliny. Tetracykliny. Biosyntéza, produkce, izolace.

Antibiotika Definice Význam Látky (přirozeného původu) působící v malých koncentracích na mikroorganizmy (ev. vyšší organizmy), především bakterie (Bakteri)cidní účinek (Bakterio)statický účinek Význam Lékařství humánní i veterinární Zemědělství a potravinářství

Antibiotika Dělení podle Účinku – inhibovaného organizmu Struktury Úzké a široké spektrum Antibakteriální, -fungální, protozoální … Struktury Producenta Zejména plísně a aktinomycety, i další – rostliny (fytoncidy) Mechanizmu působení Syntéza stěny Membrány NK Proteosyntéza

Účinnost ATB ANTIBIOTIKA Antibiotika jsou látky, které přirozeně produkují různé mikroorganismy na svoji ochranu – selektivně inhibují růst jiných mikroorganismů nebo na ně působí přímo toxicky. Selektivní působení je jedním ze základních faktorů použití antibiotik v humánní (příp. i veterinární) medicíně – toxický či inhibiční účinek se projevuje pouze vůči určitým mikroorganismům, ale ne vůči člověku. Dalším typickým znakem je působení ve velmi nízké koncentraci. Z tisíců různých antibiotik, které se v přírodě tvoří, se komerčně využívají jen některé. Hlavní antibiotika používaná v lékařské praxi jsou shrnuta v následující tabulce:

Struktury a producenti ATB

Mechanizmy působení ATB

Antibiotika Základní požadované vlastnosti Účinné v nízkých koncentracích Specificita Šíře spektra Resistence Neškodné pro ošetřovaný organizmus (apod.) Přímý účinek – projev intoxikace Alergie Residua

Penicilin b-Laktamová struktura

Penicilin Historie Problémy Řešení U nás za války – I. Málek a kol., utajení před Němci Problémy Nízká produkce, povrchový růst Řešení Nové kmeny Mutace

Penicilin Historie – etapy I. 1928-39, malý zájem, obtížná produkce, nízké výtěžky (P. notatum), konkurence sulfonamidů II. 1939-41, potřeba účinných léčiv na bojištích, intenzivní výzkum a vývoj III. 1942-45, laboratorní výsledky převedeny do výroby, povrchová kultivace P. chrysogenum IV. 1943-52, vývin submerzní fermentace, zlepšení technologie izolace. Prekurzorování – objeveno při výzkumu stimulace produkce kukuřičným výluhem (vliv přítomného fenylacetátu, pak i jiné deriváty)

Penicilin Biosyntéza

Epimerace L-Val AaCysVal IPN – Penicilin G Další deriváty Fenoxymetyl – PV Heptyl – PK

Penicilin Produkce Naočkování spor do bohatého media – růst 7 dní při 24 oC Přeočkování do inokulačního fermentoru 1 – 2 dny, nárůst mycelia Přeočkování do produkčního fermentoru 6 – 7 dní Izolace

Penicilin Významné komponenty media Podmínky Zdroj C – sacharidy (laktosa, glukosa) Zdroj N aj. – kukuřičný výluh Minerální soli, odpěňovadlo – olej Podmínky Intenzivní vzduchování a míchání Obtíže pro viskozní prostředí vláknitých struktur Limituje velikost fermentorů Prekurzory – přídavek zčásti hned, zbytek přítokem

Penicilin Produkční fáze Penicilin je vylučován do media I. 0-2 dny, trofofáze. Růst mycelia, spotřeba sacharidu a N, pH roste z 5,5-6 k 7. Málo penicilinu II. 2.-5. den, idiofáze. Růst ustává, rychlá produkce penicilinu, pokles sacharidu, pH ca 7 III. 5.-6 (7). den. Produkce penicilinu klesá (později i rozklad), začíná autolýza mycelia, uvolnění NH3 Penicilin je vylučován do media Ca 1% zůstává v myceliu Ca 65% C využito pro zisk energie, 25% na růst a 10% na syntézu penicilinu

Penicilin Produkce penicilinu Jiné podmínky, doba kultivace

Penicilin – schema výroby

Penicilin Izolace Filtrace (bubnový filtr) Ochlazení – kolem 0 oC Okyselení – pH 2 – kontinuálně Extrakce – protiproudem (organické rozpouštědlo) Neutralizace – alkalický vodný roztok Extrakce do vody Okyselení a extrakce do nepolární fáze Zahuštění, krystalizace (jako draselná sůl), ev. další čištění

Penicilin

Penicilin

Penicilin Polosyntetické peniciliny Deriváty kys. 6-aminopenicilanové, jiné než přírodní Uvolnění 6-APK z přírodního penicilinu enzymaticky 6-APK též vedlejším produktem fermentace, kolísavé zastoupení Penicilinamidasa je jedním z faktorů rezistence, E. coli, imobilizovaná Acylace směsnými anhydridy nebo chloridy kyselin Charakteristika Menší účinnost (nutné vyšší dávky), vyšší cena – celkem až 20x dražší terapi Odolné vůči b-laktamase, též inhibují Rozšiřují výběr, širší spektrum účinnosti

Penicilin Polosyntetické peniciliny

Tetracykliny Deriváty

Tetracykliny Biosyntéza polyketidovou cestou Analogie s FAS

Antibiotika KS AT TH KR ACP ketosyntasa acyltransferasa thiohydrolasa ketoreduktasa ACP

Antibiotika

Tetracykliny Schema PKS typ I

Antibiotika

Tetracykliny Vznik metylmalonylCoA

Tetracykliny Fermentační produkce Obdobná jako u penicilinu Producenti Streptomyces aureofaciens - ClTC, S. rimosus – oxyTC Zdroje C Sacharidy – glukosa, sacharosa, škrob Jantaran, tuky Zdroje N Amonné soli, kukuřičný výluh (0,2%), arašídová moučka (2%) Minerální komponenty Fosfáty a sírany Ca a Mg soli – srážení TC sníží toxicitu pro mikroorganizmus

Tetracykliny Izolace Podobné penicilinu Extrakce do butylacetátu ve formě Ca(ev. Mg)-komplexů, pH 8 Reextrakce do vody zředěná kys. sírová

Děkuji za pozornost