NÁZEV ŠKOLY: ČÍSLO PROJEKTU: NÁZEV MATERIÁLU: TÉMA SADY: ROČNÍK: GYMNÁZIUM JOSEFA JUNGMANNA, LITOMĚŘICE, Svojsíkova 1, příspěvková organizace ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/1.5.00/34.1082 NÁZEV MATERIÁLU: VY_32_INOVACE_6C_12_PCR TÉMA SADY: Genetika II. ROČNÍK: 4.ročník, oktáva DATUM VZNIKU: září 2013 AUTOR: Markéta Fialová

Anotace prezentace je určena pro výuku genetiky v hodinách biologie a biologického semináře ve 3. a 4.ročníku gymnázia (a odpovídajících ročnících víceletého gymnázia) v prezentaci se studenti seznámí se základní molekulárněbiologickou metodou, polymerázovou řetězovou reakcí; je zde popsán základní postup a využití této metodyv praxi; v dnešní době je tato metoda již značně modifikovaná závěr prezentace je doplněn krátkým opakováním klíčová slova: denaturace, hybridizace, syntéza DNA, primery, DNA-polymeráza, dNTP, cykler, elektroforéza

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE

Polymerázová řetězová reakce také PCR (z anglického Polymerase Chain Reaction) molekulárněbiologická metoda sloužící ke zmnožení specifických úseků DNA využívá procesů denaturace, hybridizace a syntézy DNA pro zmnožení neboli amplifikaci určité části genomu metodou PCR jsou zapotřebí tzv.primery, DNA- polymeráza a dostatečné množství dNTP

Primery dva malé úseky DNA, které jsou komplementární ke koncovým oblastem DNA, kterou chceme namnožit (část genomu) tyto malé úseky DNA mají známou sekvenci nukleotidů tvořeny zpravidla 20- 25 nukleotidy důležité je, aby cílové (koncové) sekvence, s nimiž primery hybridizují, byly specifické jen pro vyšetřovanou oblast a nevyskytovaly se na jiných místech genomu v současnosti různé firmy komerčně vyrábějí širokou nabídku primerů umožňujících amplifikaci různých oblastí genomu člověka

Cykler přístroj patřící k nezbytnému vybavení každé molekulárněbiologické laboratoře do něj vkládáme zkumavky se směsí vyšetřované DNA, primerů, DNA- polymerázy a dNTP je možné v něm automaticky a velmi rychle měnit teplotu pro provedení jednotlivých kroků

Otevřený cykler

…dříve

…dnes

Průběh cyklu při PCR hybridizace primerů denaturace vyšetřované DNA hybridizace primerů elongace nukleotidových řetězců

Denaturace vyšetřované DNA působením zvýšené teploty (zpravidla 92- 96°C) dochází k oddálení řetězců DNA při této teplotě dochází k degradaci naprosté většiny proteinů včetně DNA- polymerázy k vyřešení tohoto problému pomohla bakterie žijící ve vývěrech horkých minerálních pramenů Thermophilus aquaticus; z jejich buněk byla izolována zvláštní, termostabilní DNA- polymeráza, která je aktivní i při velmi vysokých teplotách; označuje se jako Taq- DNA- polymeráza (Thermophilus aquaticus)

Hybridizace primerů probíhá při teplotě 45- 65°C komplementární navázání primerů na cílové sekvence vyšetřované DNA probíhá při teplotě 45- 65°C místa vazby primerů vymezují oblast genomu (oblast DNA), která bude v dalších cyklech PCR amplifikována (zmnožena)

Elongace nukleotidových řetězců prodlužování nukleotidových řetězců působením DNA- polymerázy při teplotě 72°C na 3´-OH-konce navázaných primerů nasedá DNA- polymeráza, která k primerům připojuje nové nukleotidy a tím prodlužuje řetězec ve směru 5´ 3´ tak se vytváří základ budoucího fragmentu DNA, který chceme získat

1 cyklus nestačí… cykly je potřeba vícekrát opakovat teprve ve třetím cyklu se vytvářejí dvouřetězcové fragmenty DNA o délce odpovídající amplifikovanému úseku pro vytvoření dostatečného množství je potřeba provádět zpravidla 20- 40 na sebe navazujících cyklů od jednoho úseku molekuly DNA lze získat až 1 mld kopií

PCR

Závěr PCR získáme směs obsahující velké množství amplifikovaných fragmentů pro jejich další použití je potřeba jejich oddělení od zbytku DNA nejspolehlivější metodou je elektroforéza

Elektroforéza metoda založená na izolaci molekul o rozdílné hmotnosti, popř. odlišném elektrickém náboji roztok s fragmenty DNA převádíme do jamek v tzv. elektroforetickém gelu na elektroforetické desce (agaróza se rozpustí v horké vodě, tento koloidní roztok se nalije na elektroforetickou desku a nechá se ochladit) elektroforetická deska je v aparatuře, která je připojena ke zdroji stejnosměrného proudu

Průběh elektroforézy při průchodu proudu jsou z jamek na okraji elektroforetického gelu záporně nabité fragmenty DNA přitahovány ke kladné elektrodě, protože obsahují aniontové fosfátové skupiny původní molekula DNA zůstává v jamce, protože je příliš dlouhá vytvoří-li se fragmenty o rozdílné délce (př. dvě různé alely), dojde k jejich oddělení, takže jsou pozorovatelné kratší úseky DNA procházejí gelem rychleji, nalézáme je tedy ve větší vzdálenosti od výchozí jamky fragmenty se po skončení elektroforézy zviditelňují přidáním fluorescenčního barviva, které se specificky váže na DNA a v UV světle jasně září

Elektroforéza

Fragmenty se po skončení elektroforézy zviditelňují přidáním fluorescenčního barviva, které se specificky váže na DNA a v UV světle jasně září

Využití PCR ke stanovení diagnózy geneticky podmíněných chorob (často vyvolány změnami počtu nukleotidů v příslušných genech; zkrácení nebo prodloužení genu se projeví odlišnou délkou úseků, které jsme pomocí PCR amplifikovali),př. cystická fibróza v lékařské ordinaci k vyšetření infekčních onemocnění (pomocí specifických primerů, které jsou komplementární k určitému úseku virové nebo bakteriální DNA) v kriminalistické laboratoři (díky PCR lze zpracovat i nepatrné množství biologického materiálu –krev, sperma), PCR je základem tzv. forenzní (soudní) genetiky studium archeologických nálezů (kosterní pozůstatky)

OPAKOVÁNÍ ODPOVÍDEJTE ANO/NE Primer je zvláštní termostabilní DNA- polymeráza používaná při PCR. Primer je fragment DNA, jenž se vytvoří v závěru prvního cyklu PCR. Primer je nepřečištěná DNA získaná z biologického materiálu (krev nebo kosterních pozůstatků). Primer je úsek DNA o známé sekvenci a malém počtu nukleotidů vážící se na komplementární úseky vyšetřované DNA. Primer není kruhová molekula DNA uložená v buňkách bakterií.

Správné odpovědi NE ANO

ZDROJ KOČÁREK, Eduard. Genetika. Praha: Scientia, 2008, ISBN 978-80-86960-36-4.

OBRAZOVÝ MATERIÁL Str.13-MANSKE, Magnus. wikimedia.commons [online]. [cit. 18.9.2013]. Dostupný na WWW: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pcr.png Str. 5-KOCHSTUDIO. wikimedia.commons [online]. [cit. 18.9.2013]. Dostupný na WWW: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cycler_offen.JPG?uselang=c s Str.7-RROR. wikimedia.commons [online]. [cit. 18.9.2013]. Dostupný na WWW: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:G- Storm_thermal_cycler.jpg?uselang=cs Str.6-GIAC83. wikimedia.commons [online]. [cit. 18.9.2013]. Dostupný na WWW: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Prototype_PCR_thermal_cyc ler.jpg?uselang=cs Str.17-MANSKE, Magnus. wikimedia.commons [online]. [cit. 18.9.2013]. Dostupný na WWW: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Agarose- Gelelektrophorese.png Str.18-MNOLF. wikimedia.commons [online]. [cit. 18.9.2013]. Dostupný na WWW: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Gel_electrophoresis_2.jpg