Proteomika Alice Skoumalová

Vědecký obor studující proteiny Co je to proteomika? Vědecký obor studující proteiny Proteomika Genomika PROTEin+genOME Exprese Genom Proteom +posttranslační modifikace +alternativní sestřih +alternativní zavinutí Souhrn všech proteinů v daném organismu Lidské tělo obsahuje miliony proteinů Exprese proteinů v rámci jednoho organismu se liší Souhrn všech genů v daném organismu Lidský genom obsahuje 20-25.000 genů Genom je konstantní celek

Nárůst diverzity proteinů Posttranslační modifikace Alternativní sestřih Alternativní zavinutí Primární transkript - mRNA před posttranskripční modifikací Alternativní sestřih Posttranslační modifikace Alternativní zavinutí

Posttranslační modifikace Chemická modifikace proteinů po translaci Připojení funkčních skupin (acetát, fosfát, lipidy, cukry) Modifikace amino skupin Strukturní změny (tvorba disulfidických vazeb, proteolytické štěpení)

Alternativní sestřih Z primárního transkriptu (1 genu) vzniká více mRNA a tedy více různých proteinů There are four known modes of alternative splicing: Alternative selection of promoters: this is the only method of splicing which can produce an alternative N-terminus domain in proteins. In this case, different sets of promoters can be spliced with certain sets of other exons. Alternative selection of cleavage/polyadenylation sites: this is the only method of splicing which can produce an alternative C-terminus domain in proteins. In this case, different sets of polyadenylation sites can be spliced with the other exons. Intron retaining mode: in this case, instead of splicing out an intron, the intron is retained in the mRNA transcript. However, the intron must be properly encoding for amino acids. The intron's code must be properly expressible, otherwise a stop codon or a shift in the reading frame will cause the protein to be non-functional. Exon cassette mode: in this case, certain exons are spliced out to alter the sequence of amino acids in the expressed protein.

Alternativní zavinutí Protein se zavinuje tak, aby byla co nejmenší jeho volná energie Existuje však několik alternativních konformací Lokální minima (alternativní konformace) Globální minimum (nativní stav)

Základní schéma analýzy užívané v proteomice Směs proteinů 1. Separace 2D-PAGE Jednotlivé proteiny 2. Izolace Štěpení trypsinem Peptidy 4. Sekvenční analýza Fragmentace peptidů 3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie Hmotnostní spektra peptidů Sekvence peptidů 5. Porovnání s databází Identifikace proteinů

a velikosti (migrace) ve druhém rozměru 2D gelová elekroforéza Proteiny jsou rozděleny podle náboje (izoelektrický bod) v prvním rozměru a velikosti (migrace) ve druhém rozměru Rozdělení podle izoelektrického bodu (pI) v pH gradientu Při pH nižším než pI se protein pohybuje k negativně nabitému konci Při pH vyšším než pI se protein pohybuje k pozitivně nabitému konci Protein se zastaví při pH stejném jako jeho pI 2. Rozdělení podle velikosti v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Denaturace pomocí sodium dodecyl sulfátu (SDS-PAGE); SDS se naváže na protein, má negativní náboj Aplikace elektrického pole v 90° Polyakrylamid tvoří síto; migrace proteinů dle velikosti 3. Zviditelnění Silver nebo Coomassie barvení

2D gelová elektroforéza Rozdělí současně stovky i tisíce proteinů Proteiny jsou rozprostřeny na ploše

Hmotnostní spektroskopie proteinů (MALDI-TOF) Izolované proteiny jsou trypsinem štěpeny na peptidy Analýza peptidů pomocí MALDI-TOF hmotnostního spektroskopu (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) Princip metody: peptidy jsou umístěny na matrix; vytvoří krystaly; jsou ionizovány pomocí laseru; nárůst napětí matrix způsobí vyražení iontu proti detektoru; měří se čas, než ion dorazí k detektoru (je závislý na hmotnosti iontu-čím větší hmotnost tím delší čas letu) Analýza hmotnostních spekter neznámých peptidů pomocí peptide mass fingerprinting (PMF) Princip metody: zjištěná hmotnostní spektra jsou in silico porovnány s genomem; počítačový program přenese informace z genomu do proteinů, teoreticky je naštěpí na peptidy a vypočítá jejich hmotnostní spektra; pak porovná hmotnostní spektra neznámých peptidů se spektry všech peptidů, které kóduje genom

Aplikace proteomiky v medicíně (proteomika nemocí) Úloha proteinů ve vzniku nemocí Exprese proteinů u nemocí Detekce proteinů vznikajících během nemoci je využita k diagnóze Alzheimerova choroba (amyloid β) Srdeční onemocnění (interleukin-6 a 8, sérový amyloid A, fibrinogen, troponiny) Renální buněční karcinom (karbonanhydrasa IX) Biomarkery nemocí Proteiny hrají centrální úlohu v životě organismu. Informace o proteinech způsobující onemocnění je využita pro vývoj nových léků 1. Známá 3D struktura proteinu-počítačová simulace-hledání léku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývoj individuálních léků Vývoj nových léků

Úloha proteinů ve vzniku nemocí Alzheimerova choroba (AD) Neurodegenerativní onemocnění charakterizované ztrátou neuronů a synapsí Histopatologie: amyloid ß, neufibrilární vlákna Oxidační stres Nerovnováha mezi tvorbou volných radikálů a antioxidačním systémem Důsledky: oxidace proteinů, lipidů, DNA a cukrů Oxidace proteinů Štěpení peptidového řetězce (karbonyly proteinů) Oxidace Ak zbytků (nitrotyrosin) Navázání produktů peroxidace lipidů či glykoxidace

Schéma pokusu

Úloha proteinů ve vzniku nemocí Výsledek Potvrzení úlohy oxidačního stresu u Alzheimerovy choroby Posttranslační modifikace proteinů v mozku navozená oxidačním poškozením přispívá k rozvoji AD Identifikace poškozených proteinů, které jsou potenciální cíle pro léčbu

Plasmatické biomarkery u AD Biomarkery nemocí Plasmatické biomarkery u AD Diagnóza AD Klinické projevy+post mortem (histologie) Není žádný spolehlivý diagnostický test (cerebrospinální tekutina- CSF se špatně získává) Periferní krev Asi 500 ml CSF je absorbováno do krve každý den Plasma by mohla být zdroj biomarkerů Identifikace diagnostických biomarkerů v periferní krvi za pomocí proteomiky: Vzorky krve pacientů s AD a kontrol byly analyzovány za pomocí 2D gelové elektroforézy Byly identifikovány body, které se lišily u pacientů a kontrol Tyto proteiny byly analyzovány pomocí hmotnostní spektroskopie

Výsledek 15 bodů signifikantně odlišných u nemocných a kontrol Analýza pomocí MS: např. 2 makroglobulin, komplement faktor H

Virtual ligand screening Vývoj nových léků Informace o proteomu vedou k identifikaci proteinů způsobující onemocnění 1. Počítačový software tyto proteiny využije jako cíle pro vývoj nových léků Např. protein způsobující onemocnění-3D struktura-počítač vyvine látku, která ho inaktivuje (navázání na aktivní místo inaktivuje enzym) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-počítač vyvine individuální lék, který je efektivnější Virtual ligand screening HIV 1-proteasa: Štěpí HIV protein na menší funkční proteiny; virus nepřežije bez tohoto enzymu (nejvýznamnější cíl léčby HIV)

Otázky Mechanismy nárůstu diverzity proteinů (3) Metoda pro separaci směsi proteinů; princip Metoda pro identifikaci proteinů, peptidů; princip Schéma pokusu pro identifikaci rozdílů v proteinové expresi u nediferencovaných a diferencovaných neurálních buněk Schéma pokusu pro hledání biomarkerů renálního karcinomu v plasmě Způsob použití softwaru pro vývoj nových léků

Souhrn Proteomika studuje proteiny, hlavně jejich strukturu, funkci a interakce Genom byl již zmapován, nyní je na řadě proteom (miliony proteinů) Metod, které proteomika využívá je velké množství, mezi základní patří 2D gelová elektroforéza a hmotnostní spektroskopie Proteiny určují fungování organismu a jejich patologie spouští nemoci; proto je proteomika zásadní pro zjišťování příčin chorob, diagnózu a léčbu