Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese In vitro metody Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese

1.1 Manipulace s DNA 1) Chemické metody Izolace (srážení, purifikace) Separace (elektroforéza) Hybridizace/denaturace 2) Enzymatické metody Štěpení (restrikční endonukleázy) Ligace (lepení) (ligázy) Syntéza (DNA polymerázy) PCR

Izolace nukleových kyselin DNA: Střižné napětí (štěpení) Stabilní v zásaditém prostředí RNA: RNázy (jsou všude) Stabilní v kyselém prostředí Postup: Lyze buňky (enzymaticky, mechanicky, chemicky, osmoticky) Odstranění proteinů (fenol/chloroformová extrakce) Srážení DNA/RNA (NaAc + ethanol) Centrifugace (sraženina) Resuspendace v pufru/vodě

Centrifugace Rychlostní: Sediment x supernatant Separace: Buněk Sraženiny (DNA) Organely Gradientová: CsCl gradient Sacharózový gradient

Gelová elektroforéza Separační i analytická metoda vzorek - marker Separační i analytická metoda Náboj je úměrný velikosti Agarózový gel Stejnosměrné elektrické pole Ethidium bromid Iluminátor 8000bp 5000bp 4000bp 3000bp 1500bp 1000bp 500bp +

Pohyblivost závisí na: Délce DNA molekuly Konformace (kruhová x lineární) Koncentraci agarózy Napětí

Denaturace + hybridizace Denaturace = oddělení řetězců DNA Podmínky: teplota, činidlo (hydroxid, formamid, močovina) Hybridizace: opačný proces než denaturace (i DNA:RNA) Použití: Lokalizace intronů, hybridizační sondy, PCR

Restrikční endonukleázy Štěpí dsDNA Palindromatické sekvence Použití: Štěpení specifických míst Štěpení s definovanými konci

Restrikční mapa DNA molekuly

Ligace Tvorba fosfodiesterové vazby mezi 2 řetězci DNA Enzym ligáza Preference: kohezní konce Spotřeba ATP

SalI ligáza TGCATGGTCAGTATGCG ACGTACCAGTCATACGCAGCT TGCATGGTCAGTATGCGTCGACAGTACGAGCAATCGATG ACGTACCAGTCATACGCAGCTGTCATGCTCGTTAGCTAC TCGACAGTACGAGCAATCGATG GTCATGCTCGTTAGCTAC Restriktáza + ligáza = systém pro úpravu DNA molekul Molekulární DNA klonování

Enzymová syntéza DNA Komponenty: 1. ssDNA (templát) 2. Specifický primer (cca 20 bp) - chemická syntéza 3. dNTP + pufr (Mg2+) 4. DNA polymeráza Použití: Značená DNA sonda Tupení přesahujících konců PCR (amplifikace úseku DNA) Mutagenesis in vitro DNA polymerázy: Bakteriální DNA pol. I Klenowův fragment (nemá 5→3 exo) Archae - termostabilní (Taq, Pwo) Souvislosti: DNA - Replikace

Použití enzymatické syntézy DNA 1. Vytvoření sondy 2. PCR 3. Cílená In vitro mutageneze 4. Tvorba copy DNA

1. Značení DNA (sondy) Značky: Radioaktivní (32P) Fluorescenční Dále detekovatelná značka (např. protilátkou) Způsoby: Značení konců Primer extension Nick translation

1. In situ hybridizace Sonda Fixace buňky, denaturace Hybridizace Lokalizace mRNA: deltaC RNA Danio rerio (zebrafish) Lokalizace genů: Lidský 5. chromozóm 6 genů Jadérko: rRNA

2. Polymerase chain reaction (PCR) Amplifikace konkrétního úseku DNA, vymezeného primery templátová DNA 2 primery DNA polymeráza dNTP Princip: cyklické trojkrokové střídání teploty: 94 0C – denaturace 50-65 0C – hybridizace (templát + primer) 72 0C – syntéza (termostabilní polymeráza) Thermus aquaticus

VIDEO

2. Forenzní genetika - Kdo je vrah? Genetický materiál pachatele Genetický materiál podezřelého Osoba A Osoba B Osoba C ???

Odbočka - mikrosatelity Mikrosatelity (short tandem repeats) Počet repetic se při replikaci může změnit: Uklouznutí DNA pol.: inzerce/delece Polymorfismus D7S820

DNA fingerprinting Kdo je vrah???

3. In vitro mutagenesis DNA fragment jako kruhová ssDNA (vektor: M13 fág) Primer - obsahuje mutaci (inzerce, delece, substituce) Syntéza DNA Rozeznání nového řetězce (není methylovaný, α-S-dNTP) Degradace starého řetězce, nová syntéza VIDEO Souvislosti: Metody - Genové inženýrství

3. In vitro DNA mutagenesis Přehled strategií

4. Syntéza cDNA Copy "DNA" = produkt reverzní transkripce mRNA Neobsahuje introny: Lze exprimovat v bakteriích Kratší úsek Klasický postup: Poly(T) primer Reverzní transkripce Degradace RNA (RNáza H) Syntéza 2. vlákna DNA: primer z RNA nebo specifický primer

DNA - detekce/amplifikace Detekce, in vitro amplifikace, in vivo amplifikace Genové inženýrství

1.2 Manipulace s proteiny Separace proteinů Chromatografie SDS elektroforéza Izoelektrická fokusace 2. Identifikace proteinu Hmotnostní spektrometrie 3. Protilátky Výroba protilátek Průtoková cytometrie Fluorescence-activated cell sorting

1. Chromatografie Separace látek podle vlastností Sloupcová chromatografie: colona + matrice + vzorek Rozdělení molekul podle rychlosti (záleží na matrici) Typy: afinitní, gelová filtrace, ionexová

1. SDS PAGE Princip stejný jako DNA elektroforéza, ale proteiny se liší nábojem Denaturace SDS - udělí proteinu náboj úměrný velikosti Redukční činidlo (merkaptoethanol, DTT): redukce S-S můstků Gel: polyakrylamid VIDEO

1. Izoelektrická fokusace + 2D ELFO Izoelektrický bod = pH při kterém je celkový náboj proteinu nulový Izoelektrická fokusace - separace proteinů podle náboje Gradient pH - protein putuje a mění náboj 2D elektroforéza: izoelektrická fokusace + SDS elektroforéza

2. Hmotnostní spektrometrie Izolace proteinu Štěpení na fragmenty (trypsin za K, R) Ionizace vzorku (např. MALDI) Určení m/z fragmentu (např. TOF) 5) Fingerprinting - hledání v databázi

2. Sekvenování proteinů (MS/MS) Postup jako při fingerprintingu Peptidy se dále štěpí (srážka s N2) Fragmenty se analyzují na MS Rozdíl mezi vrcholy: 1 aminokyselina Rozeznání C a N konce - značení Trojitý kvadrupól

3. Protilátky Velmi široké uplatnění v biologii: Detekce proteinů Výroba protilátek: Imunizace myši Izolace B buněk (slezina) Fúze s leukemickou buněčnou linií Selekce hybridomů Selekce žádoucích hybridomů Imunogen: Zejména proteiny ale i jiné molekuly (lipidy)

3. Průtoková cytometrie Princip: Kapilára Buňky procházejí skrz laser Měření fluorescence Použití: Povrchové proteiny (protilátky) Proteiny uvnitř buňky (po permeabilizaci) Obsah DNA (fluorescenční barva) Velmi dobrá kvantitativní analýza

3. Fluorescence-activated cell sorting Aplikace průtokové cytometrie Kapce se udělí náboj podle signálu Třídění směsné populace buněk

1.3 Analýza genové exprese Metody sledování exprese individuálního genu Northern + Western Kvantitativní RT-PCR 2. Sledování celkové genové exprese Microarrays Proteomika (Pozn. metody bez použití genového inženýrství)

1. Northern blotting Southern blotting (přesátí): DNA elektroforéza Přesátí na membránu (např. nitrocelulóza) Inkubace se značenou DNA sondou Spíše in vitro mapování molekul Northern blotting: Izolace RNA → RNA elektroforéza Přesátí na membránu Kvantifikace množství mRNA genu (transkripce)

1. Wester blotting (immunoblotting) Izolace proteinů SDS PAGE Transfer na membránu Inkubace s protilátkou (někdy primární + sekundární) Detekce Umožňuje kvantifikaci množství proteinu

1. Kvantitativní RT-PCR VIDEO Terminologický problém: (RT = real time/reverse transcription) Slouží k určení množství konkrétní mRNA Probíhá ve dvou fázích: Syntéza cDNA Amplifikace cDNA (klasické PCR) Sledování množství produktu v reálném čase (fluorecescence) TaqMan

2. Microarray (DNA čipy) Porovnání celkové genové exprese 2 vzorky (2 tkáně, 2 podmínky růstu, zdravá tkáň x nádor) Izolace mRNA z tkáně Syntéza značené cDNA (2 různé fluorofory) Hybridizace na čipu (kotvená cDNA) Měření fluorescence (poměr) VIDEO

2. Proteomika Porovnání proteomu ze 2 vzorků Klasický postup: 2x 2D ELFO (i jiná vícerozměrná separace) Obrazová analýza Identifikace spotů (MS) Nové metody: Fluorescenční značení vzorků - směs

Shrnutí Molekuly DNA lze izolovat, separovat, štěpit, lepit, množit Značená DNA sonda může být použita k detekci NA in situ PCR = základní mol. biologická metoda (např. forenzní genetika) Proteiny lze in vitro separovat (SDS PAGE, 2D ELFO) Lze vyrobit protilátku proti (libovolnému) proteinu FACS počítá a třídí buňky podle fluorescence Exprese genu lze sledovat jako množství mRNA nebo proteinu Analýza transkriptomu/proteomu ukáže globální změny GE

Co si určitě zapamatovat? Elektroforéza DNA Restrikční štěpení + ligace DNA sondy PCR cDNA Hmotnostní spektrometrie Protilátky Průtoková cytometrie Metody sledování genové exprese