KOMPLEMENTFIXAČNÍ REAKCE, NEUTRALIZACE Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU www.mmilab.bl

Osnova Opakování Dynamika titru Komplement Komplement fixační reakce Neutralizační test

Opakování Přímé metody: hledáme mikroba, jeho části nebo produkty (antigeny, toxiny,...). Infekční agens je přítomno nyní. Nepřímé metody: hledáme protilátky vytvořené makroorganismem, které vznikly jako odezva na činnost mikroba. Infekční agens bylo přítomno někdy v minulosti.

Přehled nepřímých metod precipitace (J06) aglutinace (J06) aglutinace na nosičích (J06) komplementfixační reakce (KFR) (J07) neutralizační reakce (J07) metody se značenými složkami: Imunofluorescence ELISA Western blot

Interpretace nepřímých metod Průkaz antigenu: pozitivita = přítomnost mikroba v těle pacienta Průkaz protilátek: pozitivita = pacient se s mikrobem setkal. Kdy? Nutno odhadnout dle: Relativní množství protilátek (titr) a jeho změny v čase (dynamika titru) Třídy protilátek – IgM/IgG Avidita protilátek (na počátku infekce jsou přítomny nízkoavidní Ab)

Interpretace – primární a sekundární imunitní odpověď Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně IgM i IgG Pacient po prodělané infekci: malé množství protilátek, pouze IgG (imunologická paměť) Chronická infekce: různé možnosti podle aktivity infekce, mikrobiálního druhu apod. http://nfs.unipv.it

Párová a nepárová séra Párová séra – dva vzorky: první uchováván v ledničce do doby, než dorazí vzorek druhý – rekonvalescentní (v rozmezí 10 – 21 dní). Oba jsou pak hodnoceny naráz. Signifikatní je čtyřnásobný vzestup titru mezi jednotlivými vzorky  akutní infekce. Nepárová séra – dva vzorky, ale nejsou vyšetřovány společně. Zvětšuje se tak riziko náhodné chyby, a proto jako důkaz akutní infekce nestačí čtyřnásobný titr, ale osminásobný titr.

Titr protilátek Titr = nejvyšší ředění, kde ještě vidíme pozitivní reakci. (Máme-li dvě řady, je titrem nejvyšší ředění z obou řad dohromady.) Prokazujeme reakci imunitního systému  ta může být velice variabilní mez jednotlivými pacienty. Málo reaktivní pacient (nízká hodnota titru i v akutní fázi infekce) vs. velmi reaktivní pacient (vysoká hodnota titru i po uplynutí dlouhé doby od prodělán infekce).

Titr protilátek – dynamika titru (1) Z předchozího slidu vyplývá, že se tedy nelze spolehnout na samotnou výši titru, ale je nutno vycházet z dynamiky výše titru. Po prvním styku s Ag trvá až 10 dní, než je lze detekovat běžnými serologickými metodami  v prvních dnech infekce jsou serologické reakce často negativní.

Titr protilátek – dynamika titru (2) Velikost a dynamika titru neodpovídají klinickým příznakům!!! Množství protilátek vrcholí často až po vymizení příznaků. Lze prokazovat také pokles titru  subakutní infekce. Serokonverze = v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“. Serokonverze vyžaduje, aby pozitivní nález ve druhém vzorku byl o jedno ředění vyšší než základní ředění (např. základní ředění 1:4, pozitivní nález ve 2. vzorku alespoň 1:8)

Titr protilátek – dynamika titru (3)

Komplement (1) Součást nespecifické (humorální) imunity Systém sérových a membránových glykoproteinů. Nejdůležitější proteiny jsou C1 – C9. Komplement váže komplex Ag-Ab, nemůže samostatně vázat Ag a samostatně Ab. Fungují v kaskádě: nejprve dojde ke štěpení neaktivní složky na menší biologicky aktivní část (mediátory zánětu C3a, C4a a C5a) a větší proteolyticky aktivní část (proteinové fragmenty b) konečný produkt: komplex atakující membránu mikroorganismu  vytvoří pór  lyze buňky

Komplement (2)

Komplement – aktivace Liší se od sebe způsobem aktivace C3 složky. Nejdůležitější moment při aktivaci komplementu je tvorba C3b z C3. 3 různé cesty aktivace kaskády: Klasická – aktivace komplexem Ag-Ab, nutná přítomnost protilátek. Alternativní – aktivace povrchem patogenu, C3b slouží k opsonizaci patogenu. Lektinová– lektiny = proteiny schopny specificky rozpoznávat a vázat volné i vázané cukry.

Komplement fixační reakce Reakce využívá vlastností komplementu – vazby na komplex Ag-Ab a schopnost komplementu lyzovat buňku. Samotná vazba komplementu na Ag-Ab komplex není viditelná  přidávají se indikátory. Indikátorový systém je tvořen Ag a Ab, aby se na něj mohl komplement také navázat: Ag = beranní erytrocyty Ab = králičí Ab proti beraním erytrocytům (amboceptor)

Komplement fixační reakce – princip (1)

Komplement fixační reakce – princip (2) Pozitivita: sediment erytrocytů (komplement je vyvázán komplexem hledaného Ag a Ab) Negativita: hemolýza erytrocytů (nedošlo k vyvázání komplementu  zlyzoval ery) Používá se morčecí komplement, ne pacientův. Inaktivuje se zahřátím tak, aby nebyly poškozeny pacientovy protilátky (30 min/56 minut).

Falešná pozitivita a negativita KFR Falešná negativita: Příliš mnoho komplementu hemolyzuje ery i v přítomnosti hledaného komplexu Ag-Ab Nutná kontrola – titrování komplementu Falešná pozitivita: Některá složka séra vyvazuje komplement sama o sobě, případně je sérum kontaminované Předcházíme tomu testem antikomplementarity = běžně provedený test, ale bez přidání Ag  pokud i tak dojde k vyvázání komplementu, nehodnotí se výsledek a krev je odebírána znovu

Neutralizační reakce Neutralizační reakce: serologické metody, při nichž protilátka brání běžným projevům antigenu (nejčastěji viru) Virus neutralizační test – Ab neutralizuje infekčnost viru – buněčná/tkáňová kultura je naočkována směsí viru. Pokud je přítomno Ab  beze změny (metabolický efekt, pH, fenolová červeň). Hemaglutinační inhibiční test – v přítomnost Ab není virus schopne aglutinovat erytrocyty (pozor, ne hemolyzovat!!!) ASLO = průkaz antistreptolyzinu O (protilátky schopné vyvolat autoimunitní reakci), nejde o nepřímý průkaz!

ASLO – diagnóza pozdních následků streptokokových infekcí Po každé infekci streptokokem dochází k tvorbě Ab, včetně Ab proti streptolyzinu O = streptokokový toxin Pokud po skončení infekce stoupá množství těchto Ab, dochází ke zkřížené reakci s některými strukturami organismu = pozdní následky strept.infekcí (revmatická horečka, glomerulonefritida) ASLO: zjišťuje míru protilátkové odpovědi po prodělané streptokokové infekci – hledáme přímo protilátky, ne patogen.

Úkol 1: Ověření funkce indikátorového ystému pro KFR Jaké složky jsou nutné pro správnou funkci indikátorového systému? Pozn. Amboceptor = králičí protilátka proti beraním erytrocytům Výsledek: 1), 3), 4) – není hemolýza 2) – hemolýza

Úkol 2: Schematická analýza KFR vč. testování antikomplementarity Ve schématech určete, kde zůstává v první fázi volný komplement – zakroužkujte, co platí Slovně popište výsledek (hemolýza, sedimentace erytrocytů)

Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (1) Pacient: dlouhotrvající respirační problémy, minimum klinických projevů. Nejpravděpodobnější diagnóza: atypická pneumonie (může být způsobena respiračními viry, vzácně některými bakteriemi – Mycoplasma, Chlamydia) Pokud je agens bakterie, účinkovala by ATB terapie

Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (2) Celá destička patří jednomu pacientovi. Testujeme 6 respiračních patogenů, každý je ve dvou řádcích (vzorek akutní a vzorek rekonvalescentní). První sloupec = test antikomplementarity. Další sloupce = ředění séra. Ve druhém sloupci 1:5, dále geometricko řadou s koeficientem 2. 5 virů (chřipka A, chřipka B, parainfluenza, adenovirus, RS virus), 1 bakterie (Mycoplasma pneumoniae).

Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (3) Odečtěte titry KFR u jednotlivých pacientů. Zakreslete výsledky, zapište titry, pokuste se interpretovat závěr. Věnujte pozornost testu antikomplementarity!

Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (4) Chřipka A: oba titry 1:5 (pacient se s onemocněním setkal dříve, nejde o akutní onemocnění. Chřipka B, parainfluenza, adenovirus, RS virus: žádné protilátky, pacient se s infekcí nikdy nesetkal. Mycoplasma pneumoniae: vzestup titru z 1:10 na 1:160 (16násobný vzestup  signifikantní výsledek)  podezření na probíhající akutní infekci způsobenou Mycoplasma pneumoniae

Úkol 4: Stanovení protilátek (klíšťová encefalitida) 3 pacienti s podezřením na klíšťovou encefalitidu. Všichni neurologické potéže, anamnéza po přisátí klíštěte. 1. řádek = pozitivní kontrola 2. a 3. řádek = první pacient Karel 4. a 5. řádek = druhý pacient Leona 6. a 7. řádek = třetí pacient Monika První z obou řádků odpovídá akutnímu vzorku séra, druhý rekonvalescentnímu. 1. sloupec = test antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1:4 (dále 1:8, 1:16, 1:32,...)

Úkol 5: Stanovení protilátek (toxoplasmóza) Několik pacientů s podezřením na protilátky proti toxoplasmóze. Toxoplasma gondii = tkáňový parazit, definitivním hostitelem je kočka. Seronegativita = nikdy se s infekcí nesetkal nebo infekce probíhá příliš krátce na detekci protilátek. Seropozitivita = nutno bližší zkoumání. 1. řádek = pozitivní kontrola 1. sloupec = test antikomplementarity (neřešíme dynamiku titru) Rozhodněte, zdali je výsledek pozitivní/negativní/antikomplementární.

Úkol 6: ASLO (1) neutralizace hemolýzy streptolyzin O za běžných okolností (nepřítomnost protilátek) – hemolyzuje červené krvinky Negativní = hemolýza v přítomnosti protilátky antistreptolyzinu O dochází k zábraně hemolýzy a krvinky mohou sedimentovat Pozitivní = zábrana hemolýzy

Úkol 6: ASLO (2) Odečet destičky = naležato První řádek je pozitivní kontrola, další řádky jsou jednotliví pacienti Hodnoty ředění jsou uvedeny v protokolu

Úkol 6: ASLO (3) Výsledky: vysoké riziko pozdních následků je u pacientů číslo 3 a 4 (506, resp. 337 m. j.) hraniční riziko je u pacienta č. 1 (225 m. j.) a u pacienta č. 7 (180 m. j.) u pacientů č. 2 a 6 riziko prakticky není, titry jsou, ale nízké pacient číslo 5 se vůbec nesetkal s příslušným antigenem (je-li vyšetřován pro „prodělanou angínu“, šlo nejspíše o angínu virového či jiného nestreptokokového původu)

Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (1) Několik pacientů s podezřením na klíšťovou encefalitidu, již testovaných pomocí KFR (viz úkol 4) HIT jako nezávislý test k ověření výsledků KFR (pozor jedná se o jiné pacienty než v úkolu 4!) V přítomnosti Ab není virus schopen aglutinovat erytrocyty (nikoli hemolyzovat!) Pozitivní = sedimentace erytrocytů (protilátka zabránila shlukování, erytrocyty sedimentují) Negativní = shluk krvinek (protilátka nebyla přítomna nebo jí byla příliš málo, nedokázala zabránit viru ve shlukování krvinek)

Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (2) Odečtěte výsledky HIT u klíšťové encefalitidy – čtyři pacienti (K, L, M, N), u každého akutní a rekonvalescentní sérum 1.řádek = pozitivní kontrola 1.sloupec = ředění 1:5, dále geometrickou řadou s koeficientem 2 (1:10, 1:20, ...) Učiňte pravděpodobný závěr (akutní infekce/pouze paměťové protilátky/...) Kontrola Ag – kontroluje, že antigen (virus) bez protilátky je schopen shlukovat Kontrola erytrocytů – kontroluje, že erytrocyty neshlukují samy od sebe

Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (3) Mělo by vyjít: jeden z pacientů je zřejmě akutně nemocen dva se s infekcí setkali jeden se nesetkal

Po tomto cvičení byste měli umět Vysvětlit, co je dynamika titru. Rozumět pojmu komplement. Popsat komplement fixační reakci včetně příkladů jejího použití. Diskutovat falešnou pozitivitu a negativitu KFR včetně toho, jak těmto situacím zabránit. Popsat princip neutralizčních testů včetně příkladů. Znát použití metody ASLO.