Biotechnologie Rostlinné biotechnologie – farmaceutické produkty Marek Petřivalský Katedra biochemie PřF UP

Rostlinná biotechnologie molecular farming/pharming

„Molekulární farmaření“ aplikace metod molekulární biologie ve výrobě komerčních produktů v rostlinách a) produkty rostlinám vlastní lipidy, sacharidy, proteiny produkty sekundárního metabolismu b) produkty „cizího“ původu proteiny farmaceutika - protilátky, vakcíny bioplasty

Přehled sacharidů Polysacharidy celuloza škrob cyklodextriny fruktany oligofruktany Polysacharidy celuloza škrob cyklodextriny fruktany pinitol manitol trehalosa cyklodextrin

Biosyntéza sacharidů vakuola cytosol plastid Trehalosa Cyklodextiny Sacharosa Fruktany Manitol myo-inositol Pinitol UDP-glukosa Glukosa-1-fosfát Glukosa-6-fosfát Fruktosa-6-fosfát Triosafosfát Glykolýza Trehalosa Cyklodextiny ADP-glukosa Hexosafosfát CO2 Škrob Amylopektin Amylosa Modifikovaný škrob plastid

ŠKROB Produkce škrobu v rostlinách 30% potrava a krmiva 70% průmyslová výroba Za normálních podmínek: 20-30 % amylosa (lineární: po ochlazení krystaluje) 70-80% amylopektin (větvený: hůře stravitelný)

ŠKROB více amylopektinu výhodné pro zpracování potravin inhibice enzymu GBS1 („granule-bound starch synthase) „amylose-free“ brambory 2) více amylosy výhodné pro průmyslové použití inhibice enzymu SBE („starch-branching enzyme“) „high-amylose“ škrob z brambor

Cyklodextriny 6-8členné kruhy glukopyranosy hydrofobní kapsa pro rozpouštění hydrofobních farmak (steroidy ...) Výroba cyklodextrinů: a) biotechnologie bakteriální fermentace kukuřičného škrobu b) možnost transgenních brambor cyklodextringlykosyltransferasa (Klebsiella sp.) - plastid malá konverze škrobu - pouze 0,01-0,001% nedostupnost nerozpustných granulí pro enzym?

Polyfruktany rozpustné polymery fruktosy uložené ve vakuole opakování struktury (G-F-Fn) inulin (cibule, topinambura, čekanka) levany (stonky a listy trav)

Transgenní rostliny a) tabák (bakteriální enzymy) - hromadění fruktanů levansukrasa (B. subtilis) fruktosyltransferasa (Streptomyces spp.) b) brambory přesměrování spotřeby sacharózy na úkor škrobu levansukrasa (Erwinia amylovora) 12-19% fruktany x snížený výnos hlíz bramboru c) kukuřice gen z B. amyloliquifaciens F any 70-90 mg/g semene d) cukrová řepa - gen SST z topinambury „sacharosa-sacharosa fructosyltransferasa“ - oligofruktany „ fruktanová řepa“ - nízkokalorická sladidla, probiotika

Metabolické inženýrství rostlinných lipidů Kys. palmitová (16:0) Kys. stearová (18:0) Kys. olejová (18:1) Kys. linolová (18:2) Kys. a-linoleová (18:3) Kys. eruková (22:1) Metabolické inženýrství rostlinných lipidů úprava přirozených lipidů syntéza nových látek

Úpravy vlastností lipidů 1) mastné kyseliny s kratším řetězcem (kosmetika …) kys. laurová 12:0 (přirozeně kokos a palmy) gen pro acylACP thioesterasu v řepce olejné 2) mastné kyseliny s delším řetězcem (průmyslové oleje) kys. eruková 22:113 : HEAR (high-erucic acid rape) zvýšená exprese genu pro elongasu zatím nemůže soutěžit s minerálními oleji 3) stupeň nasycení (požadavek uniformity lipidů pro průmysl) zvýšený obsah kys.stearové 18:0 - inhibice desaturasy zvýšený obsah kys. olejové 18:1 - inhibice desaturasy řepka olejná , soja x odolnost na chlad

Výroba speciálních MK 4) výroba speciálních MK v rostlinách známo 210 různých mastných kyselin a) kys.petroselenová 18:16 : Umbelliferae (koriandr) oxidací 03 = kys. laurová a adipová - výroba nylonu tabák transformovaný genem pro desaturasu z koriandru

Výroba speciálních MK b) kys. linolenová (18:36,9,12) (12 hydroxyolejová) - skočec obecný kys. arachidonová (20:45,8,11,14 ) esenciální MK a prekursory eikosanoidů transformace tabáku - mikrosomální desaturasy genem z brutnáku (6 -desaturasa) genem z houby Mortierella alpina (5 -desaturasa) kys. rikolenová“ - enzym 12-hydroxylasa klonována

zdroj ricinového oleje Skočec obecný zdroj ricinového oleje

Bioplasty biodegradovatelné polymery zatím vyráběné mikrobiální biotechnologí PAH = polyhydroxyalkanoáty PHB = polyhydroxybutyrát polyhydroxyalkanoát polyhydroxybutyrát

Biosyntéza PHB biosyntéza PHB v baktérii Alcaligenes eutrophus Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA 3-hydroxybutyrát-CoA Polyhydroxybutyrát 3-ketothiolasa Acetoacetyl-CoA reduktasa PHB synthasa Biosyntéza PHB biosyntéza PHB v baktérii Alcaligenes eutrophus vychází z acetyl-CoA

PHB v Arabidopsis klonovány geny pro tři klíčové enzymy transformovány do Arabidopsis nejlepší výsledky při přenosu do chloroplastu PHB: 40% DW v plastidu x poruchy růstu

PHB v Arabidopsis plastid cytosol acetyl-CoA malonyl-CoA acetoacetyl-CoA 3-hydroxybutyryl-CoA PHB isoprenoidy flavonoidy (phaC) plastid (phaB) cytosol acetyl-CoA lipidy

PHB v Arabidopsis plastid cytosol acetyl-CoA malonyl-CoA acetoacetyl-CoA 3-hydroxybutyryl-CoA PHB isoprenoidy flavonoidy (phaC) plastid (phaB) cytosol lipidy (phaA)

kumulovaný v chloroplastech Polymer PHB kumulovaný v chloroplastech

Polymer PHA PHA (polyhydroxyalkanoát) kopolymer, delší řetězce méně krystaluje, elasticita akumulace v Pseudomonas růst na kyselém substrátu Transgenní Arabidopsis gen pro phaC1 z P. aeruginosa akumulace PHA v glyoxisomech a peroxisomech v množství 4 mg/g DW

„Molekulární farmaření“ Výroba vína

Molekulární pěstování proteinů principiálně teoreticky snadné problémy: správné složení, post-translační úpravy, snadnost purifikace, ekonomická výhodnost 1) Enzymy pro průmyslové a zemědělské použití 2) Farmaceutické přípravky a) protilátky - imunoglobuliny, řetězce Ab b) podjednotky vakcín c) proteinová antibiotika

Produkce hirudinu v olejových tělískách řepky (Brassica napus) Struktura transgenu vloženého do B. napus v olejových tělískách řepky (Brassica napus) jako fúzní protein s oleosinem ve finálním kroku štěpení proteasou

Produkce hirudinu Struktura transgenu vloženého do B. napus Oleosin promotor Oleosin fúzní protein kodující sekvence terminátor exprese v transgenní rostlině do olejových tělísek rostlina B. napus homogenizace rostlinný materiál centrifugace tuková tělíska rostlinný drť přenos do čisté zkumavky štěpení proteasami tuková tělíska na povrchu protein v rozpustné fázi Oleosin protein proteasové rozpoznávací místo

Produkce enzymů pro průmyslové použití Avidin Diagnostika Glukurodinasa Trypsin Farmaceutika, dermatologie Celulasa Výroba EtOH z celulózy Termostabilní xylanasa Zpracování biomasy Fytasa Rozklad fytátu Amylasa Potravinářství Ligninperoxidasa Zpracování papíru

Produkce enzymů ProdiGene Inc 1998 první komerční enzym TrypZeanTM rekombinantní trypsin AproliZeanTM rekombinantní aprotinin

myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogen ortofosfát Příklad: fytasa Fytasa fytát inositolmonofosfát inositol myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogen ortofosfát

Příklad: fytasa Fytát hexafosfát inositolu nestravitelný pro zvířata s jednoduchým žaludkem vysoký obsah v semenech - krmivo pro zvířata vylučování ve výkalech - znečištování fosforem Fytáza zvýšený příjem fosfátu a snížená kontaminace prostředí transgenní kukuřice (Čína), ječmen (ČR)

Protilátky produkované v rostlinách Fv fragment jednoduchý řetězec místo vazby antigenu IgG - imunoglobulin scFv jednořetězcový fragment vzniklý spojením lehkého a těžkého řetězce variabilní části IgG lehký řetězec IgG těžký řetězec Fv fragment jednoduchý řetězec

Protilátky produkované v rostlinách S. mutans (zubní kaz) tabák sIgA IgG Nádor střeva Herples simplex virus soja Jednořetězové fragmenty Lymfoma scFV (38C13) Karcinoembryonní antigen obilniny scFvT84.66

Protilátky „na zakázku“ syntéza sekreční protilátky IgA v transgenní rostlině syntéza funkční IgA byla dosažena postupným křížením transgenů pro jednotlivé řetězce

„Molekulární farmaření“

Vakcíny produkované v rostlinách Lidské E.coli enterotoxin B tabák 0,001% SLP V. cholerae CtoxB podjednotka brambor 0,3% TSP Hepatitis B pláštový protein 0,1% FW Norwalk vir protein kapsidu 0,23% TSP vzteklina glykoprotein rajče 1% TSP Zvířecí kulhavka epitope VP1 vojtěška koronavirus kukuřice parvovirus VP2 protein Arabidopsis 3% SLP

Vakcíny Prof. Charles Arntzen transgenní rajčata obsahující Norwalk virus antigen „jedlá“ vakcína z rajčat

„Vakcíny budoucnosti“ Zrna transgenní kukuřice obsah dávky 1mg B-podjednotky toxinu E.coli Kukuřičný „snack“ připravený ze stejného množství zrn Frakce získaná z kukuřičných zrn koncentrace antigenu cca 6x vyšší „Vakcíny budoucnosti“

Biofarmaceutika produkovaná v rostlinách Somatotropin Human Tabák - Interferon Rýže, tabák Serový albumin -Antitrypsin Rýže Laktoferrin Brambor Aprotinin Kukuřice Enkefalin Arabidopsis Hirudin H. medicinalis T. kirilowii Trichosantin

Trichosanthes kirilowii Biofarmaceutika Pijavice - Hirudo medicinalis Trichosanthes kirilowii