Zlepšování podmínek pro výuku technických oborů a řemesel Švehlovy střední školy polytechnické Prostějov registrační číslo : CZ.1.07/1.1.26/

Barvení podle Grama Autor: Ludmila Trunečková

Barvení podle Grama Jedno ze základních barvení v mikrobiologii. Objevil v roce 1884 Christian Gram. Rozděluje bakterií na Gram pozitivní (G+) a Gram negativní (G-). Toto dělení je založeno na různé stavbě bakteriální stěny. Staphylococcus aureus Salmonella typhy G + G- g

Grampozitivní bakterie G + Mají stěnu tvořenou proteoglykanem a polysacharidy, kterými prochází kyselina teichoová. Při barvení se krystalová violeť dostává do buněk a tvoří s Lugolovým roztokem modrou komplexní barvu. Alkohol není schopný prostoupit buněčnou stěnou a rozpustit komplex. Dobarvení karbolfuchsínem dodá bakteriím tmavě fialovou barvu. G + koky: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus;StaphylococcusStreptococcusEnterococcus G + bacily: Corynebacterium, Clostridium, Listeria, Bacillus.CorynebacteriumClostridiumListeriaBacillus

Struktura buněčné stěny G+ bakterií

Gramnegativní bakterie G - Mají stěnu tvořenou tenkou vrstvou proteoglykanu a vrstvou lipopolysacharidu. Při stejném postupu dochází ve třetím kroku k vyplavení komplexu alkoholem a k odbarvení. Karbolfuksin dobarví bakterie červeně. G – koky: Neisseria;Neisseria G – bacily: Klebsiella, E. coli, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Vibrio, Pseudomonas, Proteus, Helicobacter pylori, Yersinia, Campylobacter, Salmonella, Bacillus fragilis, atd.KlebsiellaE. coliEnterobacterCitrobacter SerratiaVibrioPseudomonasProteusHelicobacter pylori YersiniaCampylobacterSalmonellaBacillus fragilis

Struktura buněčné stěny G- bakterií

Postup Gramova barvení: 1) Příprava a fixace preparátu. 2) Barvení krystalovou violeti. 3) Barvení Lugolůvým roztokem. 4) Odbarvení actonem. 5) Dobarvení karbolfuchsínem 6) Sušení mezi dvěma filtračními papíry. 7) Pozorování imerzním systémem.

Příprava preparátu Dobře vyčištěné podložní sklo protáhneme plamenem přidáme kapku vody. Mikrobiologickou kličkou naneseme z plotny malé množství bakteriální biomasy do připravené kapky vody a rozmícháme na sklíčku v jemně zakalenou suspenzi. Kličkou rozetřeme suspenzi do plochy tak, aby vznikl tenký souvislý film. Ten necháme bez zahřívání na vzduchu uschnout.

Fixace preparátu Cíl fixace - je kromě stabilizace preparátu i usmrcení buněk, neboť barvení mrtvých buněk dává lepší výsledek. Při mechanické fixaci se stěr fixuje dvojím či trojím protažením nad horní částí svítivého plamene hořáku, celková doba ohřevu nesmí přesáhnout dobu 2 sekund. Fixace se prověří přiložením preparátu k zápěstí – podložní sklíčko musí být horké, nikoliv žhavé (70–80 °C). Při chemické fixaci se preparát ponoří na 10–15 minut do nádoby s fixativem (metylalkoholem, acetonem) a po fixaci se usuší na vzduchu.

Mechanicky fixovaný preparát Podložní sklíčko Vysušená a zfixovaná suspenze mikrobiologie.unas.cz/soubory/mikroskopie.pps

Barvení krystalovou violetí a Lugolovým roztokem Fixovaný a zchladlý roztěr na podložním sklíčku převrstvíme roztokem krystalové violeti a necháme působit 30 vteřin. Poté bez oplachování barvu slijeme, převrstvíme preparát Lugolovým roztokem a necháme působit opět 30 vteřin. Pak barvu slijeme. Krystalová violeť Lugolův roztok

Barvení karbolfuchsínem Pak barvu slijeme a oplachujeme opatrně destilovanou vodou a odbarvujeme v šikmé poloze acetonem tak dlouho, dokud odtéká barvivo. Preparát dokonale opláchneme destilovanou vodou a dobarvíme zředěným karbolfuchsinem po dobu 30 s. Preparát se promyjeme destilovanou vodou a vysušíme filtračním papírem. oplach acetonem Karbolfuchsin

Schéma Gramova barvení D.jpg

Zdroje %C3%AD %C3%AD Veselá, M., Drdák, M.: Praktikum z obecné mikrobiologie, 1999, VUT Brno

Děkuji za pozornost !