Éra testování: výzkum biomarkerů u karcinomu plic Marc van de Vijver Academic Medical Centre Amsterdam, The Netherlands

Co je biomarker? Charakteristika, kterou je možno objektivně měřit a použít jako indikátor normálních biologických procesů, patologických procesů nebo farmakologické odpovědi na léčebnou intervenci 1 1 Biomarker Definitions Working Group, Biomarkers and Surrogate Endpoints: Preferred Definitions and Conceptual Framework. Clin Pharmacol Ther 2001;69:89–95

Prognostické versus prediktivní markery: důležitý rozdíl Prognostický marker Indikuje pravděpodobnost výsledku (rekurence nádoru nebo přežití nemocného) bez ohledu na specifickou léčbu nemocného Prediktivní marker Indikuje pravděpodobnost odpovědi na specifickou terapii Některé markery mohou mít jak prognostický, tak prediktivní význam – stanovení je proto obtížené

Řada kroků vedoucích k zavedení klinicky použitelného a užitečného markeru Klinická validace vybraného kandidáta za použití metody pro stanovení Vznik hypotézy o biomarkeru Vývoj metody pro stanovení Vývoj dokonalejší komerčního metody pro stanovení Povolení metody a její distribuce do laboratoří Identifikace možných kandidátů Audity k zajištění konsistence a validity výsledků

Metody testování molekulárních biomarkerů Exprese proteinu –imunohistochemie (IHC) –kvantitativní stanovení imunosorbentem s navázaným enzymem (ELISA) Exprese genu –Stanovení technologií „microarray“ nebo polymerázovou řetězovou reakcí s reversní transkriptázou (RT-PCR) Počet kopií genu –Fluorescenční / chromogenní in-situ hybridizace (FISH/CISH) Sekvence genu –Sekvencování DNA (nebo jiné metody stanovení známých mutací) Pouze IHC, FISH a ELISA jsou metody zavedené v diagnostických laboratořích – použití ostatních metod je omezeno na výzkumné laboratoře

Problémy při testování biomarkerů Dostupnost tkáně v dostatečném množství a dostatečné kvalitě Rozdílné metody testování na různých místech neumožňují přímé porovnání výsledků Validace biomarkerů a metod jejich testování je dlouhodobý proces Metody testování musí být rychlé, spolehlivé, levné a jejich zavedení v laboratořích musí být snadné Je nutná shoda názorů a kooperace mezi průmyslem a výzkumem Stanovení biomarkerů v budoucnosti (např. proteomika či genové čipy) mohou vyžadovat zcela nové technologie

EGFR aktivuje několik signálních cest, což vede k invazivnímu růstu Woodburn J. Pharmacol Ther 1999;82:241–50; Lynch TJ, et al. N Engl J Med 2004;350:2129–39 Knowlden JM, et al. Endocrinology 2003;144:1032–44; Chakravarti A, et al. Cancer Res 2002;62:4307–15 Mimobuněčný prostor Nitrobuněčný prostor PP JNKPI3KAkt MAPK Proliferace Invaze Metastazování Angiogeneze Inhibice apoptózy

Mimobuněčný prostor Nitrobuněčný prostor Tarceva  Angiogeneze  Metastazování  Adheze  Invaze  Citlivost k chemoterapii  Proliferace  Apoptóza Tarceva zasahuje do buněčných procesů aktivovaných EGFR Etessami A, Bourhis J. Drugs Future 2000;25:895–9 Moyer J, et al. Cancer Res 1997;57:4838–48 Harari PM, Huang SM. Semin Radiat Oncol 2002;12(Suppl. 2):21–6

Možné markery signální cesty EGFR PP Adaptor Transkripční faktory Jádro MAPK MEK RAF GTP-RASGDP-RAS Proliferace Přežití PIP 2 PI3K PIP 3 PTEN AKT Regulátory apoptózy

EGFR: logický biomarker pro Tarcevu? EGFR je vysoce exprimován až u 80 % případů NSCLC 1 Tarceva specificky blokuje tyrosinkinázu EGFR a přímo ovlivňuje buněčně procesy řízené tímto receptorem Signální cesta EGFR je proto logickým cílem výzkumu, ale jakýkoli biomarker klinického benefitu tarcevy musí být validován v prospektivní kontrolované studii 1 Rusch V, et al. Clin Cancer Res 1997;3:515–22

Možní biomarkery pro predikci úrovně benefitu při léčbě Tarcevou Exprese EGFR proteinu nebo exprese mRNA Počet kopií genu EGFR Mutace genu EGFR Mutace genu KRAS Jiné molekuly signální cesty, např. pMAPK a pAKT Ligandy EGFR

Imunohistochemické stanovení exprese EGFR : barvení membrán* u  10 % nádorových buněk Nekompletní barvení membrán a cytoplasmy Kompletní barvení membrán *jakékoli intenzity Tsao M-S, et al. N Engl J Med 2005;353:133–44

IHC testování IHC – metodika v patologických laboratořích obecně zavedená Avšak, IHC je metoda semikvantitativní Laboratoř musí při stanovení dodržovat správný postup a procházet přiměřenou kontrolou kvality Pro NSCLC neexistuje validovaná metoda testování (je dostupná metoda pro testování u kolorektálního karcinomu)

Stanovení amplifikace genu EGFR metodou FISH: kategorie hodnocení (Cappuzzo et al.) Disomie Vysoká polysomie Trisomie Amplifikace genu Cappuzzo F, et al. J Natl Cancer Inst 2005;97:643–55

FISH testování Od zavedení testování HER2 u karcinomu prsu je tato metoda dostupná ve více laboratořích –laboranti nemají tolik zkušeností jako s IHC FISH analýza HER2 se zpravidla provádí jen při výsledku HER2 IHC 2+ (kolem 10% všech případů)* Hodnocení je objektivní, ale v různých centrech se může lišit V současné době není k dispozici validovaný test pro NSCLC *V ČR plátci vyžadována u všech nemocných indikovaných k léčbě Herceptinem

Mutace genu EGFR: po čem pátráme? Nejčastěji pozorovanými mutacemi EGFR jsou delece exonu 19 a L858R mutace exonu 21, byla však popsána řada jiných mutací Nalezení vhodné metody stanovení je obtížení –sekvencování je časově náročně a nelze je snadno automatizovat –jsou potřebné lepší metody Pao W, Miller VA. J Clin Oncol 2005;23:2556–68

HER2 mRNA Normální úroveň HER2 proteinu Nadměrná replikace + selekce buněk s růstovým potenciálem Poučení z HER2: identifikace biomarkeru Zvýšená úroveň HER2 proteinu

Poučení z HER2: podklad pro výběr nemocných k léčbě Herceptinem

Poučení z HER2: algoritmus testování u karcinomu prsu + – FISH / CISH Vzorek nádoru nemocné IHC FISH / CISH + – Léčba Herceptinem Bilous M, et al. Breast 2003;12:92–8 Hanna WM, Kwok K. Mod Pathol 2006;19:481–7

Souhrn Identifikace a validace biomarkeru je komplexní proces, který může trvat řadu let Před nalezením biomarkeru pro NSCLC bude třeba překonat řadu překážek Pokud bude nalezen funkční biomarker (jako HER2 u karcinomu prsu), bude možná individualizovaná léčba a budou zlepšeny léčebné výsledky