PRŮKAZ NUKLEOVÉ KYSELINY Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU

Osnova  Nukleové kyseliny, izolace NK  Metody průkazu nukleové kyseliny  Využití průkazu nukleové kyseliny  PCR reakce a její modifikace  Možnosti detekce specifických sekvencí nukleové kyseliny

Nukleové kyseliny

Průkaz nukleové kyseliny  Metoda velice přesná a citlivá (někdy až příliš  falešné výsledky).  Pomocí detekce nukleových kyselin lze detekovat stopy mikroorganismů i v historických preparátech.  Použití:  Jiné metody jsou příliš nespolehlivé.  Jiné metody jsou příliš obtížné.

Praktické využití průkazu NK  Diagnostika:  Bakterie: Mycobacterium tuberculosis (kultivace je příliš dlouhá – týdny), Borrelia burhdorferi (kultivace je příliš dlouhá a složitá)  Viry: virus vztekliny, hepatitidy B, enteroviry, chřipkové viry, viry parainfluenzy, adenoviry, RS-virus, HSV, virus příušnic, viry způsobující průjmy  Nehodí se na detekci široce rozšířených patogenů právě kvůli přílišné citlivosti.  Nehodí se pro detekci běžně rozšířených patogenů (přílišná citlivost).

Metody průkaz NK – přehled  Metody bez amplifikace:  Genetické sondy  Amplifikační metody:  Polymerase chain reaction = PCR  Ligase chain reaction = LCR  NASBA

Genetické (genové) sondy  Metoda, při níž je proces hybridizace vizualizován pomocí značených molekul sondy (např. biotin, digoxigenin,…).  Hybridizace = proces, při němž jsou spojována dvě komplementární vlákna DNA v souladu s pravidly o párování bází.

PCR– složky  Polymerázová řetězová reakce: Karry Mullis – vyvinuta1983, 1993 Nobelova cena.  Pro reakci je třeba:  Templátová DNA  Specifické primery označující cílovou sekvenci  Termostabilní polymeráza  Deoxynukleotidy  Pufr obsahující ionty hořčíku

PCR – průběh  Probíhá v cyklech.  1 cyklus:  Denaturace – oddělení dvou vláken DNA od sebe (rozpad vodíkových můstku, z dsDNA vzniká ssDNA).  Annealing (=zacílení) – primery hybridizují ke komplementární sekvenci DNA. Teplota, při níž jednotlivé primery nasedají, je kritická a charakteristická pro každou PCR reakci.  Elongace (=prodlužování) – pomocí DNA polymerázy je řetězec DNA prodlužován. Prodlužování probíhá od 3` konce.

Polymerázová řetězová reakce

PCR – modifikace (1)  „Klasická“ PCR – po skončení je třeba analyzovat produkty pomocí gelové elektroforézy.  Real-time PCR – možnost sledovat přírůstek produktu v reálném čase po každé proběhlém cyklu. Nejčastěji se používá kvantitativně (qPCR).  Reverzně transkripční PCR (RT-PCR) – k analýze RNA.

PCR – modifikace (2)  Nested PCR – používají se dvě sady primerů ve dvou po sobě jdoucích PCR reakcích. Omezuje se tak vznik nespecifických produktů.  Multiplex PCR – v jedné reakci je přítomno několik cílových míst.  Specifická PCR – specifická pro určité geny kódující enzymy, faktory patogenity atd.  Univerzální PCR – cílovou sekvencí je úsek DNA společný všem bakteriím, nejčastěji 16S rRNA.

PCR – výsledek „klasické“ PCR

PCR – výsledek qPCR

PCR – interní kontrola (1)  Velice senzitivní reakce, takže může být velice snadno inhibována přítomností různých interferujících látek.  K detekci těchto látek se používá směs, která obsahuje krom vzorku takové kontrolní DNA a druhou sadu primerů.

PCR – interní kontrola (2)  Pozitivita interní kontroly  nedošlo k inhibici reakce.  Pozor! U velice silně pozitivní vzorků může být interní kontrola negativní!  Interpretace s PCR:  Pozitivní vzorek i pozitivní interní kontrola = pozitivní výsledek.  Pozitivní vzorek a negativní interní kontrola = může se jednat po silně pozitivní výsledek.  Negativní vzorek i negativní interní kontrola = negativní výsledek.  Negativní vzorek a pozitivní interní kontrola = negativní výsledek.

DNA mikročipy (1)  Oligonukleotidy (krátké úseky DNA) známé sekvence (=sondy) jsou přichyceny k podkladu na známých místech (=spotech).  Následuje izolace příslušné NK a její amplifikace (DNA – PCR, RNA jako CDNA – RT-PCR).  Amplifikovaná NK je označena fluorescenčním barvivem (Cy3, Cy5).  Posledním krokem je hybridizace značeného vzorku se sondami na čipu.  Vše, co se nenazávalo je odmyto při promývání.  Je zachycována míra eliminace fluorescence a vyhodnocována bioinformaticky.

DNA mikročipy (2)

LCR  Obdoba PCR – jde o amplifikaci DNA pomocí dvou těsně sousedících sond a ligázy.  Tyto dvě sondy a ligáza tvoří specifičtější primer pro následnou PCR.  Používá se k detekci SNP (single nucleotide polymorphism).

NASBA  Nucleic acid sequence based amplification  Amplifikace RNA – používá se např. pro diagnostiku a kvantifikaci HIV v séru.  Reakce izotermická, při 41 °C.  Složky:  Templátová RNA  2 primery (1 z nich obsahuje promotor pro T7 RNA polymerázu)  Reverzní transkriptázu  Rnázu H (v hybridech DNA/RNA odbourává RNA)  T7 RNA polymerázu

NASBA

Sekvenování DNA  biochemické metody zjišťující pořadí nukleotidových bází v sekvenci DNA  Maxam–Gilbertova metoda (chemické sekvenování, radioaktivní značky, dnes téměř nepoužívaná)  Sangerova metoda (současná modifikace: fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé dideoxynukleotidy)  Pyrosekvenování (uvolnění pyrofosfátu z nově začleněného nukleotidu dalšími reakcemi je energie v  pyrofosfátu (difosfát) využita na vznik ATP využito  luciferázou k oxidaci luciferinu a emise světelného kvanta)  Next-generation sequencing (NGS)

Pyrosekvenování

Úkol 1: Izolace DNA (1)  Promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu (nebo směsí fenol/chloroform).  Fenol se používá k oddělení proteinů od NK. Proteiny (hydrofobnější) zůstanou v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a přejdou do fáze vodné.  Chloroform v reakci denaturuje proteiny, rozpouští tuky a pomáhá oddělení jednotlivých fází získaných při centrifugaci.

Sangerova metoda (1)  Současná modifikace: fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé dideoxynukleotidy.  Proces „připomíná“ PCR:  Místo dvou primerů pouze jeden primer  Krom deoxynukleotidů ještě dideoxynukleotidy  Detekce elektroforézou (gelová nebo kapilární)

Sangerova metoda (2)

Vzorek pro sekvenování  Vzorek do laboratoře  izolace DNA  amplifikace DNA  vizualizace gelovou elektroforézou  vyříznutí vzorku z gelu  přečištění  sekvenace

Analýza výsledků sekvenace  Bioinformatické přístupy  BLAST – Basic Local Alignment Search Tool (NCBI)  Vyhledávání podobností v databázi.

Úkol 1: Izolace DNA (2)  Centrifugace – oddělení fází:  Spodní fáze = organická – tvořena fenolem (směsí fenol/chloroform)  Mezifáze – denaturované proteiny a zbytky buněk  Horní fáze = vodná – v ní jsou rozpuštěny NK  Odebereme horní fázi a NK vysrážíme pomocí etanolu.  Shromáždíme precipitát NK – centrifugací a následným rozpuštěním sedimentu ve vhodném roztoku.

Úkol 2: Amplifikace specifických úseků NK  Prohlédněte si video, přečtete text, zodpovězte otázky.

Úkol 3: Detekce PCR produktu gelovou elektroforézou  Pro detekci se přidává barvivo (Ethidium bromid, SYBR Green)  Interkalační barviva: vmezeřují se mezi báze v malém žlábku DNA  Ozáření gelu UV  Navázané barvivo emituj světlo  Produkty putují od katody směrem k anodě (NK je záporně nabitá)  Nutná přítomnost interní kontroly a ladderu.

Úkol 3a: Detekce PCR produktu

Úkol 3b: Speicifická detekce PCR produktu pomocí gelové elektroforézy

Úkol 4: Srovnání výsledků průkazu DNA s výsledky průkazu protilátek  Nemůžeme se spoléhat na výsledek jedné jediné reakce.  Nutno kombinovat znalosti výsledků z různých reakcí.  K dispozici: výsledek PCR (přímý průkaz), výsledek reakce ELISA (nepřímý průkaz)

Úkol 4a: PCR NK u lymeské borreliózy

Úkol 4b: Průkaz protilátek proti původci lymeské borreliózy  A1 – negativní kontrola  B1 – cut off č. 1  C1 – cut off č. 2  D1 – pozitivní kontrola  E1 – pacient P1  F1 – pacient P2  G1 – pacient P3  Cut off = (B1 + C1) / 2  Interpretace platí pro IgM i IgG

Úkol 4c: Závěr úkolů 4a a 4b

Úkol 5: Průkaz DNA pomocí PCR s detekcí produktu pomocí ELISA (1)  Viz. Praktikum J08 – ELISA k průkazu protilátek byla také použita jako součást předchozího úkolu.  V tomto úkolu nejde o sérologické použití této reakce.  Detekce produktu PCR pomocí ELISA.  Vedle důlku vzorku také důlek patřící interní kontrole.

Úkol 5: Průkaz DNA pomocí PCR s detekcí produktu pomocí ELISA (2)  A1 = pozitivní kontrola,  D1 = negativní kontrola  B1 a C1 = důlky cut off (cut off = jejich průměr)  hodnoty nad „cut off“ (referenční hodnota) jsou považovány za pozitivní hodnoty.  E1, F1, G1, H1 = pacienti 1, 2, 3, 4  E2, F2, G2, H2 = interní kontroly k 1, 2, 3, 4  pozitivní reakce = pozitivní výsledek  negativní reakce, positivní IC = negativní výsledek  negativní reakce, negativní IC = inhibice reakce

Úkol 6: Real-time PCR  vyhodnoťte pozitivní a negativní kontroly a čtyři obrázky Real- time PCR, které máte na pracovním stole  osa x ukazuje počet cyklů  osa y vyjadřuje množství produktu  pozitivní křivka by měla dosáhnout limitní linie („threshold“) před 42. cyklem  plná čára označuje produkt vlastní reakce, čerchovaná čára ukazuje interní kontrolu

Úkol 7: Real-time PCR: kvantifikace  Nedetekujeme pouze pozitivitu, ale také kvantifikujeme virovou nálož.  Spočítejte virovou nálož u čtyř případů podle vzorce v protokolu.

Úkol 8: správné odpovědi

Po tomto cvičení byste měli umět  Znát a popsat využití metod založených na průkazu NK.  Uvést příklady využití této detekce v mikrobiologii.  Vysvětlit postup izolace DNA a PCR.