Izolace a identifikace půdních mikroorganismů Mgr. Petra Straková Podzim 2014

Půdní mikroorganismy Půda - stanoviště nesmírně různorodé mikrobiální komunity Viry, bakterie, houby, řasy, protozoa Normální/extrémní podmínky

Půda Podporuje/umožňuje růst rostlin Mikroorganismy výrazně přispívají k úrodnosti půdy Rostliny mají velký vliv na mikrobiální komunity v půdy Kořenové exudáty a staré části rostlin – potrava pro MO Kolonie na půdních částicích, víc než ve vodním prostředí Všeobecně dostatek živin - heterotrofové

Půdní mikroorganismy Obligátní aerobové, fakultativní anaerobové, mikroaerofilní, obligátní anaerobové (záplavy – fak. a oblig. anaerobové) Teplota (roční období) – většina mezofilní, kompost - termofilové Vlhkost kyselost (plísně) – jehličnaté lesy půdní typ, dostupnost kyslíku, živin (C, N, P), atd. Bakterie, houby -> houby na povrchu, bakterie níže (nejvíc v prvních 15 cm) Archeae – extrémy v pH, polární půdy, pouštní půdy

Půdní mikroorganismy Půdní profil - Vzniká zvětráváním a následnými půdotvornými procesy -Specifické chemické a fyzikální vlastnosti -Odpovídající fauna a flora -Různá úrodnost půdy

Půdní mikroorganismy Autochtonní druhy – přirozené; ta mikroflóra, která je schopna využívat odolné huminové látky; pomalá ale konstantní aktivita (G- tyčky, aktinobakterie) Zymogenní (oportunistické) druhy – závislost na přítomnosti zvýšené koncentrace; vysoká růstová rychlost a aktivita díky jednoduše využitelných substrátech, ale stále autochtonní druhy Allochtonní druhy – nenachází v půdy dobré růstové podmínky Běžné druhy: Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Celulobacter, Cellulomonas, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Xanthomonas, Streptomyces, Myxococcus, Actinomyces

Půdní mikroorganismy Houby - významná část půdní mikroflóry Volně žijící, součást mykorhizy, nejvíce v horních 10cm, málo pod 30 cm Nejčastěji: Aspergillus, Geotrichium, Penicillium, askomycety, bazidiomycety Většina hub – zymogenní (oportunistické), za příznivých podmínek – adekvátní vlhkost, aerace a relativně vysoká koncentrace využitelného substrátu

Ekologická role -dekompozitoři (rozkládači), -koloběh prvků v přírodě -mutualisti (N 2 fixující organismy) -patogeni (Clostridium) -tvorba humusu – humifikace -mineralizace -tvorba půdní struktury -interakce mezi mikroorganismy a prostředím -> aktuální stav

Izolace půdních mikroorganismů 1) Mikroorganismy poutající vzdušný dusík (Azotobacter) 2) Izolace klostrídií 3) Izolace celulotytických mikroorganismů Izolace v čistých kulturách, využití selektivních médií Čím jsou tyto skupiny zajímavé?

Azotobacter Azotobacter - G- bakterie, aerobní, netvoří spóry, druh náročný na podmínky prostředí, ve vzduchu a ve vodě, cukry-zdroj E využit při fixaci N 2 Některé bakterie umí fixovat vzdušný dusík za pomocí enzymu nitrogenázy (energeticky velmi náročné), buď ve spojení s rostlinami nebo samostatně volně v půdě Redukce plynného dusíku na NH 3 za striktně anaerobních podmínek !! v našem případě – spotřebování kyslíku na povrchu buňky aerobní respirací

Azotobacter – postup izolace Selektivní médium: Ashbyho agar – bezdusíkaté médium Rozdrobíme zeminu a kultivujeme 72 hodin °C Vyrostou pouze ty bakterie, které umí fixovat dusík z atmosféry

Clostridium G+ bakterie, obligátně anaerobní, tolerantní ke kyselému prostředí, dobře snáší i nižší teploty (rozmezí °C), malé nároky na prostředí, tvoří endospory (oválné či kulaté), v počtu buněk/g půdy, výskyt: voda, stoční kal, půda, mořské sedimenty, GIT

Clostridium – postup izolace 10 min protřepáváme 10 g půdy v destilované vodě (100 ml), následně 2x přefiltrujeme; pasterizace 15 minut při °C ve vodní lázni Do horkého sterilního média (MPB) pipetujeme 1ml pasterizovaného extraktu a převrstvíme 1 ml parafínu

Izolace celulolytických bakterií Součástí buněčné stěny rostlin je celulóza + další těžce odbouratelné chemické látky (lignin, pektin, hemicelulóza) Na jejich rozkladu se podílí mikroorganismy, které je umí hydrolyticky štěpit až na glukózu Aerobní celulolytické organismy = ukazatele úrodnosti půdy !! Cytophaga, Cellvibrio

Celulolytické bakterie – postup izolace na Petriho misku do 2/3 rozdrobíme zeminu, navlhčíme a položíme: filtrační papír, buničinu a noviny a sledujeme jejich rozklad

Hodnocení Azotobacter – po prvních dnech kultivace slizovité bílé/bezbarvé kolonie, po týdnu hnědé slizovité kolonie (stářím hnědnou) Clostridium – sediment; zápach; tvorba plynu Celulolytické bakterie – pozorování rozkladu po 1.,2. a 3. týdnech, pigment kolonií? Hodnotíme úrodnost půdy