Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Fyzikální chemie v biochemii Základy lékařské chemie 1. ročník - letní semestr © Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. lékařská fakulta,

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Fyzikální chemie v biochemii Základy lékařské chemie 1. ročník - letní semestr © Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. lékařská fakulta,"— Transkript prezentace:

1 Fyzikální chemie v biochemii Základy lékařské chemie 1. ročník - letní semestr © Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze,

2 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/20152 Obsah přednášky  The most important chapters of physical chemistry  Thermodynamics, Thermochemistry, Chemical equilibrium, Kinetics (Reaction rate, order of chemical reaction), Catalysis  Photos and films connected with history of Electrochemistry  J. Heyrovsky - Nobel Prize for polarography 1959  J. Heyrovsky – Inventor of polarography 1959  Promotion clip on polarography  Oscilopolarography (Expo 58 - Brussels)  Promotion film of J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., 2007  Promotion film of J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., 2009

3 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/20153 Fyzikální chemie v biochemii - nejdůležitější kapitoly  Fyzikální chemie je interdisciplinární obor chemie.  Využívá poznatky a metody chemie, fyziky, elektrochemie a kvantové mechaniky pro zkoumání makroskopických vlastností látek na molekulární úrovni.  Sledování fyzikální veličin spojených s chemickými (biologickými) ději

4 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/20154 Instituce  Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i.  Biofyzikání ústav AV ČR, v.v.i.  Přírodovědecká fakulta UK v Praze  Přírodovědecká fakulta MU v Brně  Zemědělská univerzita v Praze  Vysoká škola chemicko-technologická v Praze  …

5 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/20155 Historie Ústavu Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i Ústav fyzikální chemie Jaroslava Heyrovského AV ČR Ústav fyzikální chemie a elektrochemie J. Heyrovského AV ČR 1972 – Sloučení Ústavu fyzikální chemie ČSAV a Polarografického ústavu ČSAV do Ústavu fyzikální chemie a elektrochemie J. Heyrovského ČSAV 1950 – Polarografický ústav ČSAV

6 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/20156 Terminologie  Fyzikální chemie  Chemická fyzika  Biofyzikální chemie  …  Záleží na uživateli  Lékař často neví, že užívá metod z daného oboru (měření teploty, tlaku, sedimentace – fyzika)  Nezná princip metody  Užívá jen výsledků Využití fyzikální chemie

7 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/20157 Termodynamické zákony Termodynamika – nauka o přesunech energie při fyzikálních a chemických dějích 1. věta termodynamická součet všech energií v uzavřené soustavě zůstává konstantní, i když uvnitř probíhají chemické či fyzikální děje – práce se přemění v teplo a naopak: dU = dw + dq (správně by nemělo být d, ale , není totální diferenciál) U - vnitřní energie, w - práce, q – teplo Soustava uzavřená – nevyměňuje s okolím hmotu a energii (E = mc 2 ) Soustava otevřená – vyměňuje s okolím hmotu či energii vs. Izolovaný systém – matter and energy may not cross the boundary Adiabatický systém – bez přestupu tepla Diathermický systém – teplo může procházet přes rozhraní Uzavřený systém – hmota nepřechází přes rozhraní Otevřený systém – vyměňuje s okolím hmotu či energii

8 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/20158 Termodynamické zákony II 2. věta termodynamická S…entropie (míra neuspořádanosti soustavy – se vzrůstem neuspořádanosti soustavy vzrůstá i její entropie)); Q…teplo, T…teplota  teplo nemůže samovolně přecházet z tělesa chladnějšího na těleso teplejší  nelze sestavit periodicky pracující stroj, který by odebíral teplo z jediného zásobníku a konal práci přesně tomuto teplu ekvivalentní  Nelze sestrojit perpetum mobile druhého druhu  Všechny samovolné děje se dějí se vzrůstající entropií, se vzrůstající neuspořádaností soustavy

9 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/20159 Termodynamické zákony III 3. věta termodynamická Druhy energie 1.Volná energie – „ušlechtilá“, protože se může volně pohybovat a měnit (chemická, elektrická) 2.Vázaná energie – teplo, která se může pohybovat jen ve směru tepelného spádu. Přeměna na jiné druhy energie se může dít jen tehdy, když těleso teplejší předává svou energii tělesu chladnějšímu.

10 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Gibbsova energie H… Entalpie H = U+pV (přírůstek entalpie je roven teplu, které soustava přijala za konstantního tlaku, pokud se přitom nekonala jiná práce než objemová) G… Gibbsova energie G = H-TS (= Maximální vratná práce jiná než objemová, kterou soustava při konstantní teplotě a tlaku odevzdá (přijme) γ … povrchové napětí A… plocha … elektrochemický potenciál záporně vzatá práce na vyproštění 1 molu nabitých částic a převedení o nekonečně zředěného stavu

11 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Termodynamické zákony VI - Termodynamické zákony VI - Terminologie Vratný (reverzibilní): soustava prochází velkým počtem malých stavových změn, při kterých je stále v rovnováze s okolím; lze jej zastavit a obrátit směr Nevratný (ireverzibilní): všechny způsoby změn lišící se nějakým způsobem od vratného děje Izobarický: P = konst. (tlak) Izotermický: T = konst. (teplota) Izochorický: V = konst. (objem) Adiabatický: q = konst. (teplo)

12 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Termochemie Reakční teplo: teplo, které soustava přijme (odevzdá), jestliže se v ní za konstantního tlaku uskuteční daná chemická reakce v rozsahu 1 molu základních reakčních přeměn vyjádřených připojenou chemickou rovnicí, a to za předpokladu, že teplota soustavy před reakcí je stejná jako teplota po reakci a že reaktanty i produkty jsou ve stavech udaných v chemické rovnici. Reakce exotermická: ΔH < 0 Reakce endotermická: ΔH > 0 Reakce spontánní: ΔG < 0 (ΔG= ΔH-TΔS) Reakce nespontánní: ΔG> 0 Rovnováha ΔG = 0 C(s)+O 2 (g)=CO 2 (g)

13 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Termochemické zákony 1. termochemický zákon (Lavoisier-LaPlace) Uvolní-li se při chemické reakci určité celkové množství energie, pak se při opačném průběhu této reakce musí stejné množství energie spotřebovat A ↔B;ΔH A→B = -ΔH B → A 2. termochemický zákon (Hessův) Provedeme-li chemickou reakci v několika mezistupních, pak součet množství energie, který se uvolní (spotřebuje) v jednotlivých mezistupních je roven množství energie, které by se uvolnilo (spotřebovalo), kdyby reakce probíhala přímo v jednom stupni A→ B → C; ΔH A→C = ΔH A→B + ΔH B→C To nám např. umožňuje určit kalorickou hodnotu potravin jejich spálením, i když v těle jejich odbourávání probíhá v řadě mezistupňů (glukóza, tuky apod.). Výpočet reakčního tepla ze slučovacích (teplo, které se uvolní (spotřebuje) při vzniku 1 molu dané látky přímo z prvků za konstantní teploty a tlaku) nebo spalných tepel (teplo, které se uvolní při spálení 1 molu látky v čistém kyslíku za vzniku nejstálejších oxidačních produktů).

14 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Výměna tepla 2. Skupenské teplo Skupenské teplo tání = Skupenské teplo tuhnutí Skupenské teplo výparné = Skupenské teplo kondenzační 3. Termochemický zákon skupenství 1. Beze změny skupenství

15 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Výměna tepla - 1 kg vody 1. Ohřev z 0 o C na 100 o C 2. Výparné teplo (při normální teplotě varu) ~ ohřev z 0 na 540 o C 3. Teplo tání (při normální teplotě tání) ~ ohřev z 0 na 80 o C

16 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Chemická rovnováha Výchozí látka A a B, Produkty C a D V rovnováze probíhá reakce zleva doprava stejnou rychlostí jako zprava doleva Guldberg-Waagův zákon K je rovnovážná konstanta rekce K je závislá na T, P apod. Slovy: Součin molárních koncentrací reakčních produktů lomený součinem molárních koncentrací výchozích látek je po dosažení rovnovážného stavu v uzavřené soustavě konstantní. Systém, který je v rovnováze reaguje na každou změnu (teploty, tlaku, koncentrace, atd.) tak, aby tuto změnu potlačil. Le Chatelierův princip

17 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Chemická rovnováha II [C].[D] = [B].[A]=>K=1 [C].[D] > [B].[A] =>K>1 – převažují produkty [C].[D] K<1 – převažují výchozí látky Oscilační reakce: např. Žabotinského Chceme-li ovlivnit průběh vratné reakce tak, aby probíhala určitým směrem, musíme pracovat v otevřené soustavě. Budeme-li z rovnovážné směsi jednu složku odebírat, bude soustava odebrané množství stále doplňovat tak, aby se rovnováha opět obnovila. Tím můžeme dosáhnout téměř úplného proběhnutí reakce i ve směru, ve kterém v uzavřené soustavě prakticky skoro neprobíhá (K<<1)

18 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Možnost ovlivnění rovnovážného stavu 1.Odebírání produktů 2.Přidávání výchozích látek 3.Při nestejném počtu molů výchozích látek a produktů v plynné fázi (2A + B = C) změna tlaku 4.Změna teploty (Exotermické – rychlost klesá s teplotou; Endotermické – rychlost roste s teplotou) Všechny reakce v živých soustavách probíhají v takových otevřených systémech, které na sebe navazují, následná reakce odebírá produkty předcházející reakci, čímž porušuje její rovnovážný stav a způsobuje průběh v potřebném směru. A+B=C+D → D+E=F+G → G+H=I+J → J+K=L+M Látka M je jako konečný produkt metabolismu odváděna z otevřené (živé) soustavy pryč, například dýcháním nebo vylučováním. Katalyzátor: ovlivňuje rychlost, ale ne rovnováhu. Umožňuje pouze jinou reakční cestu, ale neovlivní rovnováhu!!!

19 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Rychlost reakce, řád chemické reakce Rovnováha: Reakce více než druhého řádu probíhá ve skutečnosti postupně, jako reakce složená z více podreakčních roků. Pro rychlost reakce je určující ten nejpomalejší. Reakce 1. řáduReakce 2. řádu

20 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Vliv teploty na chemické reakce Ze vztahu vyplývá, že zvýšení teploty výrazně zvyšuje rychlost chemických reakcí – vztah je exponenciální. Této skutečnosti se běžně využívají homonotermní organismy, např. při obranných reakcích, které při vyšší teplotě probíhají rychleji a jsou tedy účinnější. Koeficient Q 10 = kolikrát se rychlost změní při změně teploty o 10 stupňů ~2 Vzestup teploty zvyšuje reakční rychlost. Vztah je vyjádřen Arheniovou rovnicí: k... rychlostní konstanta, A… funkční faktor; T … absolutní teplota; E a … aktivační energie; R universální plynová konstanta.

21 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Elektrická dvojvrstva Užití: a)Elektrolýza roztoků b)Pokovování c)Zubní článek – nevhodné materiály d)Voltametrie e)Zdroje energie

22 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Redukčně – oxidační (redoxní) reakce Příklad Galvanický článek-samovolně Anoda: Zn=Zn 2+ +2e - 1. redoxní systém E 0 (Zn 2+ /Zn)=-0,76 V Katoda: Cu 2+ +2e - =Cu2. redoxní systém E 0 (Cu 2+ /Cu)=0,34 V Zn(s) + Cu 2+ = Cu(s) + Zn 2+ U=E k -E a Měření redoxního potenciálu (zopakovat si středoškolskou látku) Elektorolytický článek - Vložení napětí Anoda: Cu = Cu e - 1. redoxní systém Katoda: Zn e - = Zn2. redoxní systém Cu(s) + Zn 2+ = Zn(s) + Cu 2+ U=E a -E k Na katodě vždy probíhá redukce!

23 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Redukčně – oxidační (redoxní) reakce Redoxní pár [V]Redoxní pár[V] Li + /Li (s)- 3,04Co 2+ /Co (s)- 0,28 K + /K (s)-2,92Ni 2+ /Ni (s)- 0,25 Na + /Na (s)- 2,71Sn 2+ /Sn (s)- 0,14 Ca 2+ /Ca (s)-2,50Pb 2+ /Pb (s)- 0,13 Al 3+ /Al (s)- 1,662H + /H 2 (g)+0,00 Mn 2+ /Mn (s)- 1,18Sn 4+ /Sn 2+ +0,15 Zn 2+ /Zn (s)- 0,76Cu 2+ /Cu (s)+0,34 Cr 3+ /Cr (s)- 0,74Ag + /Ag (s)+0,80 Fe 2+ /Fe (s)- 0,44Cl 2 /2Cl - (g)+1,36 Cd 2+ /Cd (s)- 0,40Au + /Au (s)+1,50 Tl + /Tl (s)- 0,34

24 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Redukčně – oxidační (redoxní) reakce I

25 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Redukčně – oxidační (redoxní) reakce II Změna napětí: 1.Spojení dvou různých kovů 2.Spojení dvou stejných kovů v různě koncentrovaných ellytech Redoxní pár s vyšším potenciálem je oxidačním činidlem redoxního páru s potenciálem nižším.

26 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Redukčně – oxidační (redoxní) reakce III Srovnání výhodnosti různých způsobů zaopatřování energie u mikroorganismů. V závorkách jsou čísla odpovídající ΔG O’ v kJ.mol -3, cytFe 3+ a cytFe 2+ značí oxidovanou a redukovanou formu cytochromů

27 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Redoxní reakce v živých organismech Živé organismy běžně využívají redoxní reakce jako zdroj energie. Řada organických látek existuje v oxidované i redukované formě a může se účastnit přenosu elektronů, při kterém organismy získávají energii potřebnou k životu. Přenášené elektrony umožňují například přenos protonů (H + ) přes biologické membrány proti koncentračnímu spádu a umožňují tak změny pH. Nahromaděné protony při zpětném průchodu přes membrány mohou dodávat energii pro přenos jiných látek nebo syntézu ATP. Z redoxního potenciálu dvou stejných redoxních systémů můžeme vypočítat ΔG o příslušné chemické reakce ΔG o = -zF ΔE’ o (z – počet přenesených elektronů) při změně redoxního potenciálu ΔE’ o Voltů (ΔE’ o - „biologický“ standardní redukční potenciál –standardní stav pro pH=7) [A red ]=[A ox ].

28 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Redoxní reakce v živých organismech II Při aerobní přeměně látek (metabolismu)v podstatě probíhá silně exergonická (a exotermická) redoxní reakce: 2H 2 +O 2 →2H 2 O, kdy se vysoce energetické elektrony vodíku přenášejí na kyslík v řadě postupných kroků, kdy se jejich energie využívá pro životní pochody buňku (organismu). Tyto pochody budou náplní biochemie, velmi dobře jsou popsány v knize Alberts a kol.: Základy buněčné biologie. Jako přenašeče elektronů často slouží kovy vázané na bílkoviny. Spontánní reakce = exergonické (exotermní) Nespontánní reakce = endergonické (endotermní) 2H 2 (g)+O 2 (g)→2H 2 O(g) ΔG o =-242 kJ.mol -1 – exotermická (hoření) 2H 2 O(g) → 2H 2 (g)+O 2 (g) ΔG o =242 kJ.mol -1 – endotermická, rovnováha posunuta úplně vlevo, teprve při vysoké teplotě a sníženém tlaku začíná probíhat (2100 o C a 0,1 MPa je rozštěpeno 2% molekul).

29 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201529Polarografie Definice Polarografie - voltametrie Voltametrie je elektroanalytickou metodou, při níž se sleduje závislost elektrického proudu tekoucího pracovní elektrodou ponořenou v analyzovaném roztoku na jejím potenciálu, který se s časem mění (zpravidla lineárně s časem roste či klesá) Definice polarografie Polarografie pracující se rtuťovou elektrodou jejíž povrch je v průběhu měření periodicky obnovován Definice voltametrie Povrch pracovní elektrody je konstantní

30 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Kdo byl Jaroslav Heyrovský: 1.Známý pražský písničkář 2.Propagátor pornografie 3.Terorista šířící toxickou rtuť 4.Syn právníka Leopolda Heyrovského – prvního profesora římského práva na České universitě v Praze 5.1. Československý nositel Nobelovy ceny 6.Prastrýc textaře a podnikatele Michala Horáčka („Superstar“)

31 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Nobelovy ceny v Československu (udělené): 1.Akademik Jaroslav Heyrovský – za chemii Jaroslav Seifert – za literaturu Nobelovy ceny v Československu (nominace - neuděleno): 1.Edvard Beneš (míru) 2.Karel Čapek (za literaturu) 3.Milan Kundera (za literaturu) 4.Jiří Hájek (míru) 5.Václav Havel (míru) 6.Tomáš Garrigue Masaryk (míru) 7.Otto Wichterle (za chemii)

32 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Profesor Jaroslav Heyrovský Prof. Jaroslav Heyrovský (* –  )

33 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Heyrovský a Shikata

34 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201534

35 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201535

36 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Chem. Listy 16 (6), 256 (1922)

37 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ December 10 th, 1959 (37 years after discovery of polarography) was awarded Prof. Jaroslav Heyrovský by the Swedish king Gustavo Adolph VI. in Stockholm by Nobel price for chemistry

38 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Stockholm

39 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ První registrační analytický přístroj

40 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ První registrační analytický přístroj

41 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Rtuťová fontána (Španělsko) – Barcelona, Foundation Miró Doly Almaden

42 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201542Dnes

43 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Modern polarographic device – small amount of mercury (produced in Czech republic 21 st century)

44 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Inorganic analysis

45 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Meze detekce Cd ~0,01 µg/L Pb ~0,01 µg/L Tl ~0,01 µg/L Cu ~1 µg/L As ~1 µg/L Kyselina fenylglyoxylová ~0.1 mg/L Kyselina thiodiglykolová ~1 mg/L

46 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201546Aplikace Kovy (kationty): Cd, Cu, Zn, Pb, Sn, Tl, Mo, Cr, Ni, Ag, V, Hg, …Speciace (různá mocenství!!!) Anionty: Chloridy, bromidy, jodidy, jodičnany, sírany, forsforečnany, dusičnany, dusitany Organické látky: Aminokyseliny (cystein, cystin,…) Glutathion, metalothioneiny Nukleové kyseliny (adenin, guanin, thymin, cytosin, uracil) Nitrolátky (TNT, nitrobenzen) Thiodiglykolová kyselina Fenylglyoxylová kyselina Karcinogeny, toxické látky, léky, pesticidy …

47 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ LDR of various polarographic and voltammetric techniques

48 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Základní bioligandy komplexující kovy v biologických materiálech Bioligandy Aminokyseliny, oligo- a polypeptidy (např. glutathion, fytochelatiny, metalothioneiny, metaloenzymy) Makrocyklická chelátová činidla (porfyriny, cobalaminy, chlorofyly) Nukleové báze, oligo- a polynukleosidy a nukleotidy, např. fragmenty DNA Polysacharidy, glykosidy (např. rhamnogalacturonan)

49 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Metalothioneiny Metalothioneiny (savčí) Fytochelatiny aminokyselin: až 23 z toho cystein: 202 až 11 Glutathion  -Glu-Cys-Gly Indukce tvorby: Cd, Ag, As, Cu, Pb, Hg, Co  -Glu-Cys) 2 Gly PC2 (  -Glu-Cys) 3 Gly PC3 … (  -Glu-Cys) n Gly PC n Cystein

50 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201550Metalothioneiny a)Biokomplexy s více redox-aktivními centry; b)Obsahují elektroaktivní centrum představované sírou (cystein); c)Obsahují koordinované ionty kovů - Zn(II), Cd(II), Cu(I), Hg(II); d)Jsou přítomny atomy vodíku, resp. protony, které mohou představovat další elektroaktivní centra. Funkce a)Transport kovu v organismu; b)Zachytávání kovů – „čištění organismu“ - detoxikace; c)Zachycení radikálových částic – OH ·, NO · · - ochrana před poškozením DNA; d)Interakce s alkylačními činidly.

51 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ PC 2 = ( γ -Glu-Cys) 2 Gly ( γ -Glutamylcystein) 2 Glycin C 14 H 29 N 5 O 6 S 2 M. hm.=427,54g.mol -1 PC 3 = (  -Glu-Cys) 3 Gly C 26 H 42 N 7 O 14 S 3 M=772,848 g.mol -1

52 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Cd 5 Zn 2 MT (izolovaný z králičích jater)

53 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201553Fytochelatiny * Kotrba P., Macek T., Ruml T.: Collect. Czech. Chem. Commun. 64, 1057, 1999.

54 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Cíle: 1)Sledování způsobů vazby kovu v molekule za podmínek fyziologických hladin koncentrací (zejména Zn); 2)Sledování reakcí výměny iontů, které jsou podstatné pro funkci MT (Zn, Cd, Cu); 3)Rozlišení vlivu adsorpce u jednotlivých typů komplexů (EVLS, impedanční měření) na jejich chování ve výměnných reakcích; 4)Možnost elektrochemického sledování změn v molekule MT za podmínek oxidačního stresu. Prostředky: 1)Vyžití nízkomolekulárních peptidů a fytochelatinů s nižším počtem cysteinových jednotek; 2)Aplikace voltametrických a chronopotenciometrických metod v kombinaci s metodami multivariačního rozlišení křivek či EVLS.

55 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Možné způsoby vazby Cd v PC

56 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Koncentrační závislost PC 3 – Brdičkova reakce c = mol.L -1 c = mol.L -1 Parametry měření: v = 250 mV.s -1 t ak = 30 s

57 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201557DNA Adenin: Kompletní proces: 6- elektronová redukce zahrnující deaminaci Za běžných podmínek 4- elektronová Cytosin: Tříelektronová redukce (deaminace + dimerizace)

58 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ OSCILOGRAFICKÁ POLAROGRAFIE Řízené vkládání střídavého proudu (konstantní proudová chronopotenciometrie) dE/dt E ssDNA dsDNA CA G Anodická část Katodická část Málo rozpustná sloučenina s Hg Adenin je polarograficky redukovatelný v silně kyselém pH zatímco jiné nuklové baze jsou inaktivní J.N.Davidson and E.Chargraff: The Nucleic Acids, Vol.1, Academic Press, New York 1955 Palecek E.: Oszillographiche Polarographie der Nucleinsauren und ihrer Bestandteile; Naturwiss. 45 (1958) 186 Palecek E.: Oscillographic polarography of highly polymerized deoxyribonucleic acid; Nature 188 (1960) 656

59 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Techniky analýzy ADSORPTIVNÍ STRIPPING Nukleová kyselina je v nádobce s elektrolytem a acumuluje se na povrchu elektrody po určitou dobu ADSORPTIVNÍ TRANSFER STRIPPING Nukleová kyselina se zacycuje na povrchu elektrody z malé kapky roztoku (3-10  l) Nukleová kyselina je zachycena na elektrodě, ale nádobka obsahuje pouze čistý elektrolyt

60 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Cytosin na m-AgSAE M; 0,1 M acetatový pufr; pH 4,8 A. Přímé stanovení cytosinu a adeninu

61 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ m-AgSAE M; 0,1 M acetatový pufr; pH 4,8 adenin M + cytosin M v= mV.s -1 ; rce (23)

62 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ B. Nepřímé stanovení směsi adeninu a guaninu Základní elektrolyt – M NaOH + 0,4 ppm Cu 2+ 1.E acc = -300 mV  Cu 2+  Cu 1+ 2.Cu 1+ + adenin (guanin)  komplex 3.Cu 1+ /adenin (guanin) komplex je akumulován na povrchu elektrody 4.Katodický scan  Cu 1+ /adenin (guanin) komplex je redukován a desorbován 5.signál odpovídá redukci Cu 1+  Cu 0 CuSAE - není nutný žádný přídavek Cu 2+ - Cu + je tvořena řízenou oxidací Cu z elektrody - optimální dávkování Cu

63 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Směs adeninu a guaninu mixture adenine : guanine 58 : 42 CT - Calf thymus DNA; p DNA - plazmidová DNA;

64 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ C.Interakce poškozené (denaturované) DNA s komplexy osmia Os O 4 (L) L = Pyridin 1,10–Fenantrolin Bipyridyl

65 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Pyrimidinové báze – OsO 4 – Pyridin Cytosin Uracil Thymin T>>C,U>>A,G

66 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ DNA modifikovaná Os(py) na HMDE a m-AgSAE DNA 2  g.l -1 ; 0,1 M acetátový pufr; pH 4,8 1)HA Ads +e -  A - +H ads 2)A - +H +  HA Ads

67 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ hybridizační sonda sekvence sondy je navržena (syntetizována) vzhledem k sekvenci DNA, která nás zajímá cílová DNA je pomocí sondy detekována GCTTATGCTGGAAT CGAATACGACCTTA GCTTATGCTGGAAT Hybridizace DNA (RNA) je založena na principu tvorby dvoušroubovice ze dvou komplementárních řetězců

68 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Hybridizace DNA (RNA) je založena na principu tvorby dvoušroubovice ze dvou komplementárních řetězců Tento princip je v různém uspořádání využíván při řadě rutinních analýz: detekce určitých nukleotidových sekvencí detekce mutací, „polymorfismů“ v určitých úsecích genomu sledování exprese genů

69 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ imobilizovaná sonda je vystavena analyzovanému vzorku DNA (RNA) Z praktických důvodů je výhodné zakotvit jeden z řetězců („sondu“) na povrchu pokud vzorek obsahuje vlákno DNA (RNA) o sekvenci komplementární k sondě („cílovou sekvenci“), vytvoří se na povrchu dvoušroubovice („duplex“, „hybrid“)

70 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Z praktických důvodů je výhodné zakotvit jeden z řetězců („sondu“) na povrchu pokud vzorek obsahuje vlákno DNA (RNA) o sekvenci komplementární k sondě („cílovou sekvenci“), vytvoří se na povrchu dvoušroubovice („duplex“, „hybrid“)

71 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ nespecifické molekuly DNA jsou poté odstraněny (odmyty) pokud vzorek obsahuje vlákno DNA (RNA) o sekvenci komplementární k sondě („cílovou sekvenci“), vytvoří se na povrchu dvoušroubovice („duplex“, „hybrid“)

72 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ následuje detekční krok, při kterém je zjištěno, zda došlo k hybridizaci výhodné je cílovou DNA označit dobře detekovatelnou značkou (radionuklidem, fluoroforem…) nespecifické molekuly DNA jsou poté odstraněny (odmyty)

73 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ DNA „čipy“ („arrays“): aplikace mnoha sond současněaplikace mnoha sond současně aplikace různých (různě“barevných“) fluorescenčních značek – vysoce paralelní analýzaaplikace různých (různě“barevných“) fluorescenčních značek – vysoce paralelní analýza komerčně dostupné přístroje (Affymetrix…)komerčně dostupné přístroje (Affymetrix…)

74 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Elektrochemický senzor pro hybridizaci DNA: elektroda se zakotvenou hybridizační sondou na povrchu hybridizace s cílovou DNA se provede stejně jako v případě optických senzorů odezvou na hybridizační událost je elektrochemický (proudový) signál I E samotná sonda hybrid

75 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Elektrochemický senzor pro hybridizaci DNA: elektroda se zakotvenou hybridizační sondou na povrchu tzv. jednopovrchová metoda (hybridizační i detekční krok probíhá na stejném povrchu elektrody) to vyžaduje hledat takové podmínky, za kterých je pracovní povrch vhodný jak pro hybridizaci DNA, tak pro elektrochemické měření časté problémy při práci s dlouhými cílovými DNA a při analýze reálných vzorků obsahujících velká množství nespecifických molekul (NA, proteiny…)

76 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Dvoupovrchová strategie: hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody účinné zachycení a separace cílové DNA poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna a elektrochemicky stanovena povrch H detekční elektroda

77 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ detekční elektroda Dvoupovrchová strategie: hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody účinné zachycení a separace cílové DNA poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna a elektrochemicky stanovena

78 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Multikanálové čidlo 1,5 - 2 mm 3 mm mm 9 x 0,8 mm 12 mm 1 - m-AgSAE 2 - MF-AgSAE 3 - p-AgSAE 4 - p-CuSAE 5 - m-CuSAE 6 - AuE 7 - PtE 8 - GCE ____ 9 – Pt –pomocná E

79 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Dvoupovrchová strategie: využití magnetických nosičů magnetická kulička s hybridizační sondou ~1µm povrch H cílová DNA nespecifická DNA magnet detekční elektroda hybridizace separace uvolnění cílové DNA detekce

80 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Dvoupovrchová strategie: metody založené na vlastní elektrochemické aktivitě DNA nebo jejích složek („label-free“) Jelen, F.; Yosypchuk, B.; Kourilova, A.; Novotny, L.; Palecek, E. Anal. Chem. 2002, 74, metody založené na značení DNA komplexy oxidu osmičelého Bogdan Yosypchuk Miroslav Fojta Luděk Havran, Michael Heyrovský Emil Paleček: Voltammetric Behavior of Osmium-labeled DNA at Mercury Meniscus-modified Solid Amalgam Electrodes. Detecting DNA Hybridization, Electroanalysis, 2005, accepted. kovovými a metalsulfidovými nanočásticemi Wang, J.; Liu, G. D.; Merkoci, A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, mikročásticemi „plněnými“ elektrochemicky aktivními látkami Wang, J.; Polsky, R.; Merkoci, A.; Turner, K. L. Langmuir 2003, 19, enzymy

81 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Dvoupovrchová strategie: využití enzymových značek („biokatalytická amplifikace signálu“) obvykle biotinem značené DNA v kombinaci s konjugáty streptavidinu s enzymy (Streptavidin (STV) - alkalická fosfatáza (ALP)) povrch H detekční elektroda STV ALP STV ALP STV ALP Wang, J.; Xu, D. K.; Erdem, A.; Polsky, R.; Salazar, M. A. Talanta 2002, 56,

82 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ electrochemické imuno-enzymové stanovení cílové DNA modifikované Os,bipy alkalická fosfatáza Palecek, E.; Billova, S.; Havran, L.; Kizek, R.; Miculkova, A.; Jelen, F. Talanta 2002, 56,

83 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Dvoupovrchová strategie: varianta se signálními sondami (reporter probes, RP) povrch H podobné detekční techniky jako u přímého značení cílové DNA (značení Os,L; enzymy atd.)

84 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ cílová DNA akumulace značky v důsledku opakování sekvence rozpoznávané signální sondou vícenásobná hybridizace signální sondy povrch H Aplikace dvoupovrchové metody – elektrochemické stanovení délky repetitivní sekvence DNA značená signální sonda

85 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Fázová rozhraní Fosfolipidová dvojvrstva Hodrofóbní část Hydrofilní část Vodná vrstva vnitřní Vodná vrstva vnější Reálné Modelové

86 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Transport molekul a iontů přes PL membránu

87 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Gramicidin – penetrační peptidy

88 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Druhy experimentálních fázových rozhraní VolnáStabilizované (Supported) Kovová elektroda či polymer WE 1 WE 2 RE 1 RE 2

89 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Reálné schéma měřicí aparatury MeSAE Polymer Dvojvrstva

90 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Metoda Patch Clamp Klasická P-C metoda Planární P-C metoda

91 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201591Katalýza Katalyzátory: a) pozitivní b) negativní (inhibitory) U mnoha katalyzovaných (enzymatických reakcí) platí: Vliv katalyzátoru: Látka ovlivňující rychlost chemické reakce, avšak na ní se bezprostředně nepodílející, mění reakční mechanismus, mění aktivační energii, účastní se tvorby aktivovaného komplexu. A+B→AB vs. A+B+K→ABK→AB+K Katalyzátory: a) homogenní b) heterogenní

92 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Základy katalýzy Katalytický proces poskytuje alternativní reakční cestu pro tvorbu produktů Reakční rychlost vzrůstá (klesá), protože alternativní cesta má nižší (vyšší) aktivační energii než nekatalyzovaná reakce Cl· + O 3 → ClO· + O 2 ClO· + O· → Cl· + O 2 Katalyzátor neovlivňuje účinnost (výtěžek,…) reakce. Nemá žádný vliv na chemickou rovnováhu, protože jsou stejným způsobem ovlivněny dopředná i zpětná rychlost reakce Důležitost katalytických reakcí pro životní prostředí stoupá s požadavky na zvýšení efektivity (snížení energetické náročnosti) průmyslových procesů, avšak katalýza hraje přímou úlohy v mnoha procesech spojených s životním prostředím, např. katalytické procesy spojené s produkcí volných radikálů chloru, které způsobují rozklad ozónu (ozonosféry). Tyto radikály jsou tvořeny přímou reakcí UV-záření s chlorovanými či fluorovanými uhlovodíky (CFC). 2 H 2 O 2 → 2 H 2 O + O 2 (UV záření, Fe 3+,.. ) Fe 2+ + H 2 O 2 → Fe 3+ + OH· + OH − (Fentonova reakce) Fe 3+ + H 2 O 2 → Fe 2+ + OOH· + H +

93 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Příklady: Katalýza ve výrobě kyseliny sírové Výroba kyseliny sírové probíhá třístupňově, přičemž prvním krokem je příprava oxidu siřičitého, který se obvykle získává buď přímým spalováním síry, S(s) + O 2 (g) → SO 2 (g) nebo pražením pyritu 4 FeS 2 (s) + 11 O 2 (g) → 8 SO 2 (g) + 2 Fe 2 O 3 (s). Druhým krokem je oxidace oxidu siřičitého na oxid sírový. Při této reakci se jako katalyzátoru používá oxidu vanadičného V 2 O 5 2 SO 2 (g) + O 2 (g) → 2 SO 3 (g). Nakonec reakcí oxidu sírového s vodou vzniká kyselina sírová SO 3 (g) + H 2 O(l) → H 2 SO 4 (aq). Katalýza ve výrobě kyseliny dusičné Průmyslově se kyselina dusičná vyrábí oxidací amoniaku (čpavku) za katalýzy kovovou platinou za zvýšené teploty a tlaku: 4 NH O 2 → 4 NO + 6 H 2 O 2 NO + O 2 → 2 NO 2 3 NO 2 + H 2 O → 2 HNO 3 + NO V průmyslu se katalyzátory používají nejméně v 60 % chemických syntéz

94 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Ovlivnění katalytického procesu Teplota Tlak Koncentrace substrátu Koncentrace katalyzátoru Iontová síla pH Aktivátory a Inhibitory (Katalytické jedy)

95 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ PŘÍKLADY ÚČINNOSTI ENZYMOVÉ KATALÝZY rozklad 2 molů H 2 O 2 na 2 H 2 O a O 2 E a [kJ. mol -1 ] nekatalyzovaná reakce75 katalýza koloidní platinou (anorganická)49 katalýza katalasou8  Urychlení reakce při dané teplotě na desetinásobek snižuje aktivační energii o hodnotu - R.T. ln 10, tj. pro 37 °C, neboli 310,15 K o - 5,9 kJ.mol -1 (log 10)  Pro nekatalyzovanou reakci zhruba platí orientační úvaha, že zvýšení teploty o 10 °C zrychluje reakci na dvojnásobek

96 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201596Katalýza  Chemické vlastnosti katalyzátorů se liší dosti podstatně, ačkoliv některé generalizující shrnutí jsou možná.  Proton obsahující kyseliny jsou pravděpodobně nejrozšířenější katalyzátory, především v reakcích zahrnujících vodu, hydrolýzu a její reverzní procesy.  Multifunkční pevné látky jsou často katalyticky aktivní, např. zeolity, alumina, některé formy grafitického uhlíku.  Přechodné kovy jsou často používány ke katalýze redoxních reakcí (oxidace, hydrogenace).  Mnoho katalytických procesů, především těch, které zahrnují vodík, vyžadují katalýzu platinovými kovy.

97 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/201597Katalýza Katalyzátory: a) pozitivní b) negativní (inhibitory) Katalýza (v závislosti na tom, zda se katalyzátor a substráty nachází ve stejné fázi): a) Homogenní b) Heterogenní např. Pt-katalyzátor v autě (Katalýza v plynné fázi na pevném nosiči) nebo 2HI(g) =(Pt-katalyzátor)= H 2 (g) +I 2 (g)

98 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Reakční rychlost Michaelisova konstanta K m Rovnice Michaelise–Mentenové Rychlost tvorby produktu se uvádí jakožto reakční rychlost V v kinetice enzymu. V max = maximální rychlost pro danou koncentraci katalyzátoru (Dvojité) Reciproké vyjádření

99 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Grafické vyjádření rovnice Michaelise–Mentenové Kinetika 1. řádu Kinetika 0. řádu

100 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Reakční rychlost v linearizovaném grafu 1/v 0 vs. [S]

101 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Kompetitivní inhibice Alkoholdehydrogenasa CH 3 OH  HCOOH C 2 H 5 OH  CH 3 COOH Katalyzátor je kompetitivně inhibován netoxickou látkou na úkor toxického substrátu  Nejvyšší rychlost je dosažena při vyšších koncentracích substrátu [S]  V max je nezměněna  K m je zýšena Některé molekuly inhibují katalýzu kompeticí o aktivní místa. Nejsilnější inhibitory se nazývají jedy.

102 Základy lék. chemieFyz. Chem. 2014/ Kompetitivní inhibice 1/v o [S] -1 1 / V max - 1/K m 1 / V max KmKm mol.l -1 [S] v o V max K m inh


Stáhnout ppt "Fyzikální chemie v biochemii Základy lékařské chemie 1. ročník - letní semestr © Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. lékařská fakulta,"

Podobné prezentace


Reklamy Google